Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: RANDRIN QUEIROZ VIANA FERREIRA
Orientador(a): Fred Luciano Neves Santos
Coorientador(a): Ramona Tavares Daltro
Resumo: A doença de Chagas (DC) é enfermidade negligenciada causada por um hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi. Trata-se de uma doença de curso bifásico, sendo representada pelas fases aguda e crônica. Estima-se que aproximadamente 5,7 milhões de pessoas estejam infectadas em 21 países da América Latina1 e, no Brasil, este número varia entre 1,9-4,6 milhões de pessoas2. O diagnóstico da infecção depende da fase clínica da doença e baseia-se em critérios clínicos, histórico epidemiológico do indivíduo e em exames laboratoriais. Na fase aguda, o diagnóstico é realizado através de métodos parasitológicos diretos e indiretos3. No entanto, na fase crônica, devido à baixa parasitemia, utiliza-se de métodos sorológicos indiretos como, por exemplo, imunofluorescência indireta (IFI), hemaglutinação indireta (HAI) e ensaio imunoenzimático (ELISA)4. Em virtude da ausência de um teste padrão-ouro para o diagnóstico na fase crônica, a OMS recomenda a utilização de dois testes em paralelo. A combinação dos resultados define o indivíduo como positivo, negativo ou inconclusivo5. Porém, o desempenho destes testes depende, dentre outros fatores, dos antígenos usados na sensibilização da fase sólida6 e do elevado polimorfismo genético apresentado pelo T. cruzi. Por este motivo os testes apresentam desempenho variável de acordo com a região geográfica onde são usados7. Dessa forma, muitos resultados apresentam discordância entre os dois testes usados, levando a um resultado inconclusivo e havendo a necessidade de um teste confirmatório para chegar a uma conclusão diagnóstica. Todavia, a DC carece de um teste confirmatório confiável e de alto desempenho para confirmação de discordância sorológica nos testes diagnósticos. O Western blotting, até o ano de 2016, era utilizado para esta finalidade 8. No entanto, a sua produção foi descontinuada, deixando uma lacuna no diagnóstico confirmatório da infecção em todo o mundo. Uma forma de ultrapassar tais obstáculos baseia-se na utilização de proteínas recombinantes quiméricas, formadas por regiões conservadas e repetitivas de diversas proteínas do T. cruzi em uma única molécula9. Esta estratégia possibilita manter os índices de desempenho elevados mesmo quando o teste é utilizado em regiões geográficas com circulação de diferentes linhagens genéticas. Desta forma, quatro proteínas recombinantes quiméricas foram desenvolvidas pelo nosso grupo por meio de técnicas de engenharia genética, as quais foram denominadas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4. O potencial diagnóstico de todas elas foram avaliadas em estudos de fase I, II e III utilizando o ELISA indireto, ELISA duplo antígeno, microarranjo líquido e imunocromatografia como plataformas diagnósticas, com resultados de acurácia que variaram de 95 a 100% (9, 10 - 11). Com base nos resultados encontrados, o nosso grupo objetiva avaliar o potencial diagnóstico dos antígenos IBMP para diagnosticar indivíduos cronicamente infectados pelo T. cruzi utilizando o Western blotting como ferramenta diagnóstica, suprindo a necessidade de uma metodologia para ser utilizada como testes confirmatório nos casos de sorodiscordâncias.

Bolsista: DENIS AUGUSTO ARGOLO CAMPOS
Orientador(a): Fred Luciano Neves Santos
Coorientador(a): NATALIA ERDENS MARON DE FREITAS
Resumo: INTRODUÇÃO: Os cães são considerados reservatórios de importância epidemiológica para a doença de Chagas devido ao seu papel de sentinela, proximidade com os seres humanos e manutenção do ciclo de transmissão em ambientes domésticos e peridomésticos. Além disso, destaca-se a correlação existente com a soroprevalência em humanos. Mesmo com o impacto epidemiológico, a ausência de testes diagnósticos para a detecção de cães infectados é um importante entrave que traz riscos à saúde pública. Uma estratégia para ultrapassar esta limitação baseia-se na utilização de antígenos recombinates quiméricos do Trypanosoma cruzi. Nosso grupo, em um estudo de fase I, avaliou o potencial diagnóstico de quatro antígenos quiméricos e obteve resultados semelhantes aos encontrados em humanos. Desta forma, este estudo sucede ao de fase I, com um quantitativo amostral ampliado afim de avaliar os quatro antígenos quiméricos na detecção da infecção por T. cruzi por meio do ELISA indireto. OBJETIVO: Avaliar o desempenho diagnóstico dos antígenos recombinantes quiméricos do T. cruzi (IBMP-8.1, -8.2, -8.3 e -8.4) em imunoensaios para detecção de anticorpos IgG anti-T. cruzi em cães na forma crônica da doença de Chagas. MATERIAL E MÉTODOS: Os imunoensaios foram otimizados por checkerboard titration. Para o estudo de fase II foi avaliado o desempenho diagnóstico das IBMP a partir de 1.260 amostras séricas caninas provenientes de diferentes estados brasileiros. A reatividade cruzada para outras doenças infecto-parasitárias também foi avaliada em 752 amostras. Ao final, comparou-se o desempenho dos quatro antígenos com teste comercial humano adaptado à espécie canina. RESULTADOS: Os antígenos IBMP alcançaram valores de AUC que variaram entre 89,0-97,4%. O nível de exatidão variou de 87,8-96%. O maior índice de sensibilidade foi atribuído a IBMP-8.2 (90,3%), enquanto a IBMP-8.1, a IBMP-8.3 e a IBMP-8.4 obtiveram 74,8%, 72,6% e 79,6%, respectivamente. A maior especificidade encontrada foi para a IBMP-8.4 (99,6%), seguida pela IBMP-8.1 (90,6%), IBMP-8.2 (96,5%) e IBMP-8.3 (99,0%). O teste comercial adaptado, o Gold Elisa Chagas, apresentou sensibilidade de 62,3%, especificidade de 98,6% e acurácia de 89,9%. O menor índice de reatividade cruzada foi alcançado com a IBMP-8.2 com 0,9%, sendo esta molécula a que mais se aproximou de um teste ideal. CONCLUSÃO: Devido ao bom desempenho das moléculas IBMP no diagnóstico da infecção por T. cruzi em cães, estas são promissoras para a identificação da doença de Chagas canina. A utilização combinada destes antígenos é uma alternativa que visa aumentar os valores de sensibilidade e especificidade em estudos futuros, bem como em outras plataformas diagnósticas.

Bolsista: Thays Francielle Ferreira Silva
Orientador(a): GUSTAVO FONTES PAZ
Coorientador(a): LETICIA GRACIELLE TORRES DE MIRANDA ESTEVAM
Resumo: A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma doença parasitária de grande importância na medicina veterinária e na saúde pública. Sabendo disso, muitos estudos são feitos acerca do ciclo do tripanosomatídeo, seus vetores e reservatórios. É de consenso científico que a transmissão natural do agente etiológico da doença, o protozoário da espécie Leishmania infantum, ocorra principalmente pela picada de fêmeas de flebotomíneos da espécie Lutzomyia longipalpis, outros mecanismos de transmissão provavelmente estejam envolvidos na epidemiologia da LVC. Tendo isso como hipótese, o projeto tem como objetivo descobrir se as pulgas da espécie Ctenocephalides felis felis possuem capacidade vetorial, ou alguma importância no ciclo da Leishmania infantum. Pois a alta prevalência de cães infectados em regiões endêmicas com a baixa taxa de infecção natural por L. infantum no vetor biológico, reforça a hipótese da participação de outro vetor na transmissão do parasito e explica a ineficácia das medidas de controle que são direcionadas somente para o combate de L. longipalpis. Assim, o objetivo é avaliar a presença de Leishmania e outros possíveis tripanosomatídeos em pulgas retiradas de cães soro-reagentes para L. infantum e confirmar a infecção desses animais com diagnósticos moleculares. Para as análises das pulgas vem sendo usados os alvos kDNA, ITS1, hsp70 e v7v8 e para as amostras caninas, o alvo hsp70 para a PCR convencional e HaeIII para a RFLP. De 126 cães avaliados de área endêmica, 64.3% (81/126) apresentaram infestação por pulgas e foram coletadas desses animais 858 pulgas para as análises moleculares. Como resultados parciais das pulgas, para a PCR convencional utilizando o alvo kDNA, obtivemos 38.9% (67/172) de amostras positivas. Posteriormente, foram realizadas PCR-RFLP utilizando alvos mais específicos, aos genes hsp70 e ITS1 e a enzima de digestão HaeIII para comparar os padrões de amplicons obtidos. Os perfis de restrição obtidos pela digestão da enzima foram comparados com padrões obtidos pela digestão dos produtos de PCR de cepas referência de L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75M2903), L. infantum (MHOM/BR/74/PP75), L. guyanensis (MHOM/BR/75/M4147), Leptomonas collosoma (COLPROT073), Crithidia fasciculata (COLPROT 048), Herpetomonas samuelpessoai (COLPROT 067), Endotrypanum monterogei (COLPROT 151) e Blechomonas ayalai. Através desta metodologia, não foi possível obter conclusões específicas, pois os alvos utilizados não foram suficientemente específicos para diferenciar com clareza as espécies detectadas. Deste modo, iniciou-se o uso do alvo v7v8, região mais indicada e mais utilizada para análises filogenéticas dentro da família Trypanosomatidae quando não se conhece a espécie encontrada. Assim, 30% (260/858) das amostras, já foram submetidos à PCR convencional utilizando o alvo v7v8. Destas, 13% (35/260) das amostras, apresentaram amplicons próximos de 700 a 800pb, sendo este padrão esperado para amostras destes parasitos. Para identificar as espécies encontradas, as amostras positivas na PCR para o alvo v7v8 serão enviadas para sequenciamento e, posteriormente, serão feitas as análises filogenéticas. Para as amostras dos cães, até o momento foram analisadas 39.2% (49/125) das amostras de pele, destas, 46.9% (23/49) foram positivas para L. infantum utilizando a PCR-RFLP com o alvo hsp70, a análise do restante das amostras está em andamento. Desta forma, até o momento foi observado que as pulgas são hospedeiras de tripanosomatídeos, mas ainda não foi possível determinar as espécies presentes e os cães vem se confirmando positivos para L. infantum através de métodos moleculares.

Bolsista: JULIA GALLO CARVALHO
Orientador(a): ERICA ALESSANDRA ROCHA ALVES
Coorientador(a): Camila Sales Nascimento
Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer que possui a maior incidência e a maior mortalidade na população feminina em todo o mundo. Atualmente, a cirurgia, quimioterapia e/ou radioterapia são os tratamentos mais eficazes contra este tipo de câncer. Entretanto, o tratamento ainda é um desafio devido aos inúmeros efeitos colaterais e a eficiência limitada das terapias tradicionais, que diminuem a qualidade de vida dos pacientes. Por isso há grande interesse em novas alternativas terapêuticas que promovam de forma segura, a destruição das células neoplásicas sem que haja comprometimento da qualidade de vida dos pacientes. Dentro do componente celular do microambiente tumoral, os macrófagos associados a tumores (TAMs) tem despertado grande interesse. Estudos recentes afirmam que nanopartículas de óxido de ferro estimulam a reprogramação dos TAMs fazendo com que percam sua função promotora de tumores e adquiram funções supressoras de tumores. Dessa forma, este projeto visa avaliar o efeito do tratamento com nanopartículas maghemita encapsuladas com polianilina na polarização de TAMs associados às células derivadas de neoplasias mamárias. Inicialmente, as nanopartículas produzidas foram autoclavadas para utilização nos experimentos in vitro, porém como havia a possibilidade deste processo alterar a estrutura, composição e propriedades das nanopartículas, as seguintes análises foram realizadas: a) avaliação da esterilidade das nanopartículas; b) avaliação da influência do processo de autoclavagem na citotoxicidade das nanopartículas; c) avaliação da influência do processo de autoclavagem na extração e purificação de gDNA; e d) quantificação dos níveis de endotoxinas nas nanopartículas. Os resultados dos ensaios mencionados mostraram que não houve crescimento microbiano nas nanopartículas após a autoclavagem. Além disso, as nanopartículas autoclavadas não apresentaram citotoxicidade, mantiveram a propriedade de captura de DNA genômico e não possuíam níveis significativos de endotoxinas. Para o estudo in vitro, foram adquiridas 4 linhagens tumorais de mama derivadas de seres humanos (MCF-7, MDA-MB-231, SkBr3, BT474) e uma linhagem de monócito humano (THP-1). As linhagens foram expandidas e criopreservadas de acordo com as especificações do Banco de células do Rio de Janeiro. Em seguida, foi realizada a adaptação de todas as linhagens para o meio de cultura DMEM com 10% de soro fetal bovino e antibióticos. Após a obtenção do banco de células, realizou-se a determinação da concentração máxima não citotóxica (Cmaxnt) de nanopartículas para as linhagens tumorais de mama e para as células THP-1. Para isso, as células foram incubadas com concentrações crescentes de nanopartículas de óxido de ferro (0-9mg/mL) por 24 horas. Em seguida realizou-se o ensaio do MTT e verificou-se que a Cmaxnt foi de 1,5 mg/mL para as células MDA-MB-231, SkBr3 e BT474, de 3 mg/mL para as células MCF-7 e de 0,06 mg/mL para as células THP-1. Em seguida, células THP-1 foram co-incubadas com células MCF-7 em um sistema transwell com membrana de 0,4 µm. As células THP-1 foram posicionadas na câmara superior e as células tumorais na câmara inferior. As nanopartículas foram depositadas na câmara superior sobre os macrófagos na concentração de 0,06 mg/mL. Após 24 e 48 horas de incubação, o sobrenadante da cultura foi utilizado para dosagem dos níveis das citocinas pelo kit CBA Human Inflammatory Cytokines Kit (BD Biosciences) e as células tumorais foram marcadas com o kit CellEvent™ Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) e com o reagente SYTOX® AADvanced dead cell Stain e analisadas por citometria fluxo. Verificou-se que o tratamento com nanopartículas de óxido de ferro aumentou a capacidade das células THP-1 induzirem a morte por apoptose das células MCF-7. Esse aumento da destruição das células tumorais não foi associado com alterações na produção das citocinas IL-1?, IL-6, IL-8, IL-12p70, TNF-alfa e IL-10. Pretende-se ainda investigar se tal elevação dos níveis de apoptose das células MCF-7 relaciona-se com alterações nos padrões de expressão gênica dos macrófagos expostos as nanopartículas, bem como com alterações nos níveis intracelulares de ROS e de estresse oxidativo nos sobrenadantes das co-culturas. Os mesmos ensaios executados com as células MCF-7 ainda serão realizados com as células MDA-MB-231. Além disso, também serão mensurados o recrutamento das células THP-1 utilizando as duas linhagens de câncer de mama.

Bolsista: Mariana Oliveira da Cunha
Orientador(a): TATIANA GALVAO DE MELO DE OLIVEIRA
Coorientador(a): Não informado
Resumo: A ativação da proteína quinase de adesão focal (FAK), já foi demonstrada no processo de invasão do Trypanosoma cruzi (Clone Dm28c) em células musculares cardíacas. A participação de FAK no remodelamento do citoesqueleto de actina, tem apontado essa molécula como relevante em diversos processos biológicos, além de invasão por diferentes patógenos levando a ativação de diferentes vias de sinalização envolvidas com a dinâmica do citoesqueleto. Neste projeto, enfocaremos na avaliação da participação de proteínas da família de RhoGTPases, importantes na modulação dos diferentes perfis de remodelamento dos filamentos de actina, concomitante a ativação de FAK durante invasão do T. cruzi em células hospedeiras. Acreditamos que o mapeamento das moléculas envolvidas no disparo da ativação de FAK possa contribuir para o melhor entendimento deste mecanismo de invasão contribuindo com informações relevantes na biologia da interação do T. cruzi e células hospedeiras

Bolsista: NATHALIA ANDRADE COTTA DE MELLO ARAUJO
Orientador(a): Dalia Elena Romero Montilla
Coorientador(a): Nathalia Andrade de Souza
Resumo: Introdução: as internações hospitalares consideradas evitáveis, por meio de uma assistência oportuna e adequada da atenção primária, representam um importante marcador de resultado da qualidade dos cuidados de saúde nesse nível de atenção. Na Portaria 221 (17 de abril de 2008) definiu-se que o Indicador de Internações por Condições Sensíveis à Atenção Primária (ICSAP) seja utilizado como instrumento de avaliação da atenção primária e/ou da utilização da atenção hospitalar, podendo ser aplicada para avaliar o desempenho do sistema de Saúde nos âmbitos Nacional, Estadual e Municipal. Estudos realizados em outros países, especialmente na Espanha, mostram a relevância desse indicador para a população idosa. No Brasil, ainda não se dispõem desse tipo de estudos que considerem as particularidades das internações de idosos, apesar de sua intensa transição epidemiológica e do seu acelerado processo de envelhecimento populacional. Isto dificulta a comparação das possíveis desvantagens em relação à outros países vizinhos no âmbito da expectativa de vida, e mais ainda quando comparado com países desenvolvidos como o Japão. Neste trabalho compara-se Rio de Janeiro com Minas Gerais, por ser o primeiro o estado com maior índice de envelhecimento (perdendo apenas para o Rio Grande do Sul) enquanto Minas Gerais tem maior desenvolvimento da atenção básica para atenção da saúde dos idosos. Objetivo Geral: analisar as Internações dos Idosos por Condições Sensíveis à Atenção Primária (CSAP) como estratégia de avaliação da atenção primária, tal como a Estratégia de Saúde da Família oferecida pelo SUS; analisar a relação entre a cobertura dos programas de atenção básica e o nível de ICSAP assim como suas desigualdades sócio-regionais e demográficas. Método: O desenho do estudo é retrospectivo, e abrange as internações de idosos residentes no estado do Rio de Janeiro e no estado de Minas Gerais do ano 2000 a 2010 por alguma CSAP, nos hospitais e clínicas conveniadas com o Sistema Único de Saúde. A população do estudo será constituída pelo universo completo de tais internações, de ambos os sexos. A fonte de informação dos dados de internações é o Sistema de Informação Hospitalar do Sistema Único de Saúde (SIH-SUS), os censos demográficos de 2000 e 2010 são as fontes de informação dos dados demográficos e socioeconômicos. As internações serão analisadas regionalmente para que dessa forma seja possível avaliar a atenção primária oferecida aos idosos residentes em cada região de saúde dos estados analisados. Metas: contribuir para identificação do impacto da atenção básica em saúde do idoso nas condições da saúde dos mesmos. Espera-se que com essa análise seja possível oferecer um indicador de monitoramento e avaliação da eficiência dos serviços de atenção primária dos idosos.