Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: ALMERIO LIBORIO LOPES DE NORONHA FILHO
Orientador(a): Lucas Pedreira de Carvalho
Coorientador(a): Não informado
Resumo: A Leishmaniose é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. Estes parasitos infectam e sobrevivem principalmente nos macrófagos, porém outros tipos de células tais como as células dendriticas, linfócitos e neutrófilos participam na patogênese desta doença. A leishmaniose tegumentar americana (LTA) causada por Leishmania braziliensis pode causar desde a leishmaniose cutânea (LC), associada a uma ou mais úlceras granulomatosas, até as debilitantes formas disseminada (LD) ou mucosa (LM) da doença (Marsden et al., 1985; Schriefer et al., 2009; Carvalho et al., 2012). A resposta imune na LC é caracterizada por uma forte resposta inflamatória, tipicamente Th1. Linfócitos de pacientes com LC produzem IFN-y que é a mais importante citocina ativadora de macrófagos, e com isso impedem a multiplicação e a disseminação de parasitos (Ameen M., 2010). Todavia, a L. braziliensis persiste nas células infectadas e leva a grande produção de citocinas pro inflamatórias como IL1? e TNF que estão associadas à gravidade da doença ( Bottrel et al., 2001 ; Bacellar et al., 2002; Follador et al. , 2002 ; Vargas et al. , 2010 ; Carvalho et al., 2012; Santos D et al., 2018). Mais recentemente, tem sido destacado o papel de macrófagos na resposta inflamatória desde que essas células são predominantemente responsáveis pela produção de TNF e IL-1? (Santos, D et al., 2018). Além disso, células NK e T CD8+ produtoras de granzima B e perforina infiltram a lesão de pacientes com LC e induzem resposta inflamatória contribuindo para o desenvolvimento da úlcera cutânea (Novais, F et al. 2018; Santos, D et al., 2018) Corte de Pedra é um distrito do município de Presidente Tancredo Neves no sudeste do estado da Bahia. Está é uma área de transmissão de L. braziliensis onde cerca de 1000 casos da doença são acompanhados por ano. Cerca de 5% dos pacientes com LC desta área endêmica apresentam teste cutâneo negativo (DTH-) para antígenos de Leishmania. Estes são indivíduos com teste negativo para HIV e sem qualquer outra doença. Nossos dados preliminares mostram que pacientes com DTH- falham mais a terapêutica com antimonial pentavalente, e células mononucleares do sangue periférico produzem menos IFN-gama em resposta à antígenos de Leishmania quando comparados a pacientes com DTH+. A nossa principal hipótese é que pacientes DTH- falhem a terapêutica devido a uma baixa resposta Th1 local, e que a alta carga parasitária leve a uma resposta inflamatória exacerbada, contribuindo para o dano tecidual.

Bolsista: YURI MATEUS GARCIA DA SILVA
Orientador(a): Maria Helena Neves Lobo Silva Filha
Coorientador(a): Heverly Suzany G. Menezes
Resumo: 1. Justificativa e relevância. Biolarvicidas à base do Lysinibacillus sphaericus têm sido utilizados com sucesso para o controle de culicídeos, e o principal fator inseticida é a protoxina, denominada Binária (Bin). A resistência de C. quinquefasciatus à toxina Bin já foi registrada e, na maioria dos casos, ela está associada à ausência do receptor Cqm1 no microvilli intestinal, pois a ligação toxina Bin-receptor é uma condição sine qua non para a ação do L. sphaericus. O nosso grupo de pesquisa selecionou, em laboratório, colônias de C. quinquefasciatus com alto nível de resistência à toxina Bin que têm servido como um modelo para a caracterização. Uma das colônias estudadas, R2362-A1, é formada por indivíduos homozigotos para um alelo do gene cqm1 (cqm1REC) cuja mutação impede a expressão de receptores Cqm1 no epitélio intestinal, e confere alta resistência à toxina Bin. Um estudo do transcriptoma de intestinos de larvas da colônia resistente revelou que o gene que codifica a enzima panteteinase (CPIJ017593) teve um nível de repressão mais acentuado do que o próprio receptor Cqm1. A nossa hipótese é que esta molécula desempenha um importante papel na ação da toxina Bin e esta é uma investigação inédita visto que não há qualquer descrição ou caracterizaçao desta proteína em insetos. 2. Objetivos. Este estudo visa avaliar o perfil de transcrição da panteteinase em larvas de C. quinquefasciatus suscetíveis (S) e resistentes (R) ao biolarvicida L. sphaericus e contribuir para a caracterização desta molécula. Os objetivos específicos são: a) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de larvas resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. b) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de adultos (machos e fêmeas) resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. c) produzir antígeno da panteteina recombinante para produção de anticorpos e futura análise de expressão desta proteína. 3. Metodologia. As amostras de DNA serão obtidas individualmente de larvas e adultos das colônias suscetível e colônia REC. Estas serão submetidas a avaliações de transcrição quantitativa do transcrito da panteteinase em tempo real utilizando primers específicos para este gene e do gene controle. A produção de antígeno será obtida a partir de uma linhagem de Escherichia coli cepa BL21 transformada com o gene da panteteinase cultivada em meio Luria-Bertani (LB) sob indução com IPTG, segundo protocolo padrão. As proteínas recombinantes serão purificadas em resina Ni-NTA. Uma amostra de cerca de 1.5 mg será usada como antígeno, para imunização e produção de anticorpos policlonais através da empresa CélulaB (UFRS). 4. Resultados obtidos até março 2023. Em novembro 2022 houve substituição da bolsista e ingresso do atual aluno Yuri Silva levando a necessidade de treinamento e retomada dos ensaios de transcrição. Neste período o bolsista realizou todas as etapas de treinamento de biossegurança, de insetário para manipulação das colônias de Cx. quinquefasciatus, técnicas de extração e avaliação de RNA, ensaios de RT-qPCR e análise da expressão relativa de transcritos. Conforme descrito em relatório mais de cem amostras de RNA de larvas das duas colônias com avaliação quantitativa e qualitativa foram produzidas. Parte destas amostras, consideradas adequadas conforme critérios pré-estabelecidos (n= 38), foram utilizadas para a avaliação do perfil de transcrição. Após análise ao resultados válidos mostraram a expressão da panteteinase nas larvas S (n=15), com perfil variável em relação à amostra de referência. Já a expressão desta molécula nas larvas R (n= 9) foi significativamente inferior demonstrando um padrão de repressão e confirmando a hipótese deste estudo. A amostra de larvas já analisada (n= 24) será ampliada para 60 e em seguida será obtido o padrão de insetos adultos para a obtenção de um painel de transcrição de indivíduos das duas colônias nas fases jovem e adulta.

Bolsista: EVERTON RODRIGUES DE SOUZA
Orientador(a): FERNANDA DE BRUYCKER NOGUEIRA
Coorientador(a): Não informado
Resumo: O vírus chikungunya (CHIKV) é um arbovírus causador de uma doença febril aguda caracterizada por grave e debilitante poliartralgia, podendo ter manifestações atípicas como complicações neurológicas. Nestes casos, o espectro clínico entre adultos e as crianças têm sido semelhantes. Além das formas clássicas poliartralgicas, no Laboratório de Flavivírus tem-se diagnosticado casos de CHIKV em casos apresentando manifestações neurológicas graves em adultos e crianças, tais como quadros de encefalites e síndrome de Guillain Barré. O CHIKV possui três genótipos distintos - Oeste Africano, Asiático e o Leste Centro Sul Africano (ECSA) e uma linhagem descendente do genótipo ECSA - Linhagem Oceano Índico – IOL. Estudos filogenéticos no Brasil demonstrou a presença dos genótipos Asiático e ECSA, introduzidos no país quase simultaneamente a partir das regiões norte e nordeste, respectivamente. No estado do Rio de Janeiro foi identificado o genótipo Asiático em casos importados em 2014 e 2015, porém a circulação do genótipo ECSA em casos autóctones foi descrita a partir do no ano de 2016. Atualmente, o genótipo ECSA tem sido reportado como o prevalentemente no país. O reconhecimento dos genótipos circulantes, possíveis variantes genotípicas e mutações no genoma viral, possui grande relevância no monitoramento de possíveis cepas mais virulentas, podendo auxiliar na adoção das medidas de controle. Constitui também um componente essencial para o entendimento da epidemiologia da doença, caracterizando fatores que levam à transmissão e dispersão viral. Neste estudo, temos o objetivo de realizar a caracterização molecular e genotipagem dos CHIKV de pacientes com manifestações neurológicas, comparando-os à cepas encontradas em pacientes sem manifestações neurológicas, almejando identificar possíveis mutações que poderiam estar associadas às diferentes manifestações clínicas dos pacientes, podendo atuar como marcadores moleculares de gravidade neurológica, através do sequenciamento genômico e ferramentas de bioinformática. Para tal, amostras de soro e/ou LCR de pacientes com manifestações neurológicas serão analisadas e comparadas às cepas encontradas em pacientes sem tais manifestações. Até o momento, das 22 amostras selecionadas, o RNA viral de seis amostras foram extraídos com o QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA), de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. Após testes com kits de amplificação distintos, os fragmentos do genoma viral serão reversamente transcritos e amplificados através da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) com o kit Qiagen Onestep RT-PCR para posterior sequenciamento genômico (plataforma Miseq, Illumina); para a caracterização molecular, a análise e edição das sequências nucleotídicas serão realizadas com o programa BioEdit e o alinhamento com o MAFFT. O programa MEGAX será utilizado para construção do banco de sequências para a caracterização molecular, tanto de nucleotídeos quanto de aminoácidos. A genotipagem será realizada pela ferramenta online Genome Detective virus e análise filogenética por ma?xima verossimilhanc?a (ML) com o IQ-TREE, sendo as árvores visualizadas com o Figtree.

Bolsista: MAYARA PAULA LACERDA VIEIRA
Orientador(a): Danielle Maria Nascimento Moura
Coorientador(a): Não informado
Resumo: As doenças causadas por tripanossomatídeos patogênicos, que inclui gêneros como Trypanosoma e Leishmania, são geralmente crônicas, de difícil tratamento e causam, anualmente, danos à saúde e econômicos imensos a diversas comunidades. Estima-se que cerca de 1 bilhão de pessoas estejam vivendo em áreas de risco de contaminação por esses organismos, especialmente em países mais pobres e emergentes, incluindo o Brasil. O tratamento contra esses agentes causadores ainda é muito limitado, com drogas que podem se tornar tóxicas com o passar do tempo, assim, a produção de conhecimento sobre a biologia dos tripanossomatídeos pode iluminar novos caminhos para o desenvolvimento de fármacos e tratamentos menos agressivos. A biossíntese de proteínas é um processo vital para a expressão gênica e sobrevivência celular e sua primeira etapa, a iniciação da tradução, é altamente complexa e requer regulação por diversas proteínas conhecidas como Fatores de Iniciação Eucarióticos (eIFs). Dentre esses fatores, o complexo eIF4F tem papel fundamental no recrutamento do ribossomo para o mRNA. Os elementos do complexo eIF4F têm sido investigados como possíveis alvos terapêuticos, tanto em tripanossomatídeos quanto em outros organismos, e resultados de estudos com inibidores de componentes deste complexo se mostram promissores em estratégias de combate a doenças. O complexo eIF4F é formado por três subunidades: eIF4A (RNA helicase), eIF4E (proteína de ligação ao cap) e eIF4G (proteína-scaffold). Vários homólogos de cada subunidade foram descritos em tripanossomatídeos, com cinco eIF4Gs identificados em T. brucei, sendo conservados em outros outros membros da família. Dois deles, EIF4G3 e EIF4G4, são essenciais para a viabilidade celular e estão envolvidos na tradução ativa. Evidências experimentais também indicaram que a abundância desses dois homólogos de eIF4G é potencialmente regulada por mecanismos proteolíticos, como, por exemplo, os que envolvem a via ubiquitina-proteassoma. Para avaliar isso, buscamos gerar linhagens de células de T. brucei expressando versões mutantes dos fatores EIF4G3 e EIF4G4 que possam ser afetados em sua proteólise. Nos anos anteriores desse projeto, as sequências proteicas de EIF4G3 e EIF4G4 foram submetidas à predição de sítios de ubiquitinação in silico usando ferramentas online, como UbiSite, UbiPred e BDM-PUB e AlphaFold2. Os resíduos de lisina (K) com as melhores avaliações in silico foram selecionados para serem substituídos por alaninas através de mutagênese dirigida ao sítio. Um total de cinco sítios foram selecionados para EIF4G3 e para EIF4G4, os quais serão avaliados in vivo. Para isso vetores de expressão contendo os genes mutados serão transfectados por eletroporação em uma linhagem de T. brucei que expressa uma molécula de ubiquitina conjugada ao epítopo HA (UbHA). As linhagens celulares resultantes serão verificadas por western blotting para confirmar a expressão do fator mutante e da ubiquitina recombinante. O próximo passo será avaliar o fenótipo das linhagens e a possível interferência das mutações sobre a ligação covalente da ubiquitina aos fatores EIF4G3 e EIF4G4, o que será avaliado por meio de ensaios de imunoprecipitação com anti-HA, seguidos de western blotting. A abordagem pretende validar o potencial preditivo da análise in silico para identificar sítios de ubiquitinação em T. brucei. Nossos resultados também ajudarão a esclarecer os mecanismos que regulam os níveis citosólicos dos homólogos selecionados de eIF4G e seu impacto na regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos, podendo identificar pontos de controle importantes que podem ser explorados como alvos moleculares para o desenvolvimento de fármacos.

Bolsista: CLARA COELHO DA ROCHA LEITE
Orientador(a): DEBORA INACIO LEITE FIRMINO MARINHO
Coorientador(a): MONICA MACEDO BASTOS
Resumo: Os tratamentos recomendados para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) baseiam-se em uma combinação de fármacos antirretrovirais. Uma das principais classes de medicamentos são os Inibidores da transcriptase reversa não nucleosídeos (ITRNN) que apresentam elevada atividade antirretroviral, alta seletividade e toxicidade moderada. Um exemplo desta classe é a delavirdina (DLV), a qual exibe o núcleo indólico como um importante fragmento farmacofórico para a sua atividade anti-HIV-1. Analisando a estrutura química da da DLV, observa-se também a presença do grupo arilsulfonamida, que demonstrou importante papel na atividade antirretroviral de fármacos da classe dos inibidores de protease e nos inibidores do capsídeo do HIV-1. No entanto, a baixa barreira genética da DLV às mutações, pode induzir à resistência medicamentosa. Além disso, apesar dos excelentes resultados alcançados com o uso da DLV na terapia antirretroviral, ela foi descontinuada devido à alta quantidade de comprimidos necessária diariamente e severos efeitos adversos. Este fármaco também mostrou-se menos eficaz frente às cepas mutantes, quando comparado com os ITRNN disponíveis. Com isso, visando obter melhores perfis de resistência, os novos ITRNN devem ser projetados com estruturas flexíveis, para que as mutações pontuais não possam interromper suas interações com a bolsa de ligação ao fármaco. O objetivo deste trabalho é a síntese, caracterização e avaliação das atividades antirretrovirais e citotóxicas de novos potenciais ITRNN, baseados na estrutura química da DLV. Esses novos potenciais ITRNN foram planejados baseados em compostos que apresentem em sua estrutura química, importantes grupos farmacofóricos para a inibição do HIV-1, como a DLV e a isatina, amplamente explorada pelo nosso grupo de pesquisa e com comprovada atividade antirretroviral. Os novos compostos serão sintetizados através de uma rota sintética convergente, composta por seis etapas reacionais. Adicionalmente, serão realizados estudos de docking molecular para definir o modo de ligação dos ITRNN.

Bolsista: ISABELE RODRIGUES PRAXEDES
Orientador(a): YURY OLIVEIRA CHAVES
Coorientador(a): Paulo Afonso Nogueira
Resumo: A senescência celular que acompanha o envelhecimento altera a fisiologia e a capacidade de replicação das células normais do organismo e está diretamente relacionada a capacidade proliferativa e regenerativa. A longo prazo, promover um cenário imunológico conhecido como exaustão das células T. Estas alterações têm papel significativo no aumento do risco de desenvolvimento da osteoporose. O projeto pretende definir o perfil epidemiológico de imunossenescência nas PVHA sob tratamento antirretroviral que apresentam disfunção mineral óssea. Trata-se de um estudo observacional, transversal, prospectivo com PVHIV atendidas no ambulatório da FMT-HVD. Os resultados têm demonstrado que a fragilidade das PVHA estão associadas a alterações na desidrogenase lática e VLDL e principalmente pela elevação da quantidade fosfatase alcalina e de cálcio. Um perfil de exaustão celular em linfócitos que expressam CTLA-4high e PD-1high caracterizado pela baixa expressão de marcadores como IFNy, CD69 e CD28 foi observado e associado a desmineralização óssea, a baixa capacidade proliferativa dos linfócitos CD4 e CD8 circulantes e exaustão celular tem se mostrado fortes indicadores de senescência podendo, com isso, impactar o manutenção da imunidade em PVHA em uso de TARV e indiretamente com a desmineralização óssea.