Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: BEATRIZ NASCIMENTO DE ARAUJO
Orientador(a): Erika Martins de Carvalho
Coorientador(a): Não informado
Resumo: A Metabolômica que visa identificar e quantificar substâncias de baixo peso molecular (<1.500 Da), tem sido amplamente empregada em estudos para o controle de qualidade de plantas, fenotipagem metabólica e os efeitos farmacológicos dos fitoterápicos (HONG, 2016). Os estudos metabolômicos podem ser dirigidos de modo seletivo (metabolômica alvo) ou não seletivo (metabolômica global). No caso das análises seletivas, a atenção enfoca a caracterização de uma classe de metabólitos (‘target compounds’), ou em um composto específico que permite um aumento na sensibilidade e, normalmente, atentando para a quantificação do(s) analito(s). No modo não seletivo observa-se simultaneamente o maior número de substâncias na amostra visando gerar perfis metabólicos (‘metabolic profiles’) ou padrões metabólicos (‘metabolic fingerprints’) característicos de um dado fenótipo. O objetivo central desta estratégia é afiançar que os componentes bioativos representativos estejam presentes de forma consistente e uniformizada conferindo ao produto qualidade e por conseguinte eficácia e segurança. Para alcançar estes objetivos tanto estudos metabolômicos seletivos e não seletivos combinando diferentes técnicas analíticas, como RMN e CL-EM / CG-EM são utilizados para garantir melhor cobertura metabólica e consequentemente, controle de qualidade, processamento e fabricação dos mesmos. O gênero Eugenia sp., pertencente à família Myrtaceae, é largamente empregado na medicina popular, em especial para o trato de infecções gastrointestinais. Na literatura científica há estudos que mostram uma ampla atividade biológica como atividade anti-inflamatória, antibacteriana, antioxidante, antitumoral, antiviral entre outros. Estas atividades biológicas, geralmente, são atribuídas à presença de ácidos triterpênicos. Nas espécies de Eugenia são normalmente descritas a presença dos ácidos betulínico, ursólico e oleanólico. O objetivo deste trabalho foi avaliar de forma geral a porção triterpênica (‘target compounds’) dos extratos metanólicos preparados a partir das folhas das espécies Eugenia punicifolia (Kunth) DC., Eugenia brasiliensis Lam. e Eugenia florida DC., em diferentes estações do ano. A coleta das folhas das E. brasiliensis e E. florida foi realizada em espécies localizadas no Jardim Botânico do Rio de Janeiro, e as folhas de E. punicifolia na Universidade Federal do Amazonas. Todo material coletado, seguiu o mesmo protocolo de limpeza e higienização seguido de pesagem e secagem em estufa a aproximadamente 40ºC. As folhas foram trituradas em moinho de facas e submetidas a extração por maceração em etanol por 7 dias. Na prospecção fitoquímica foi identificada a presença de ácidos triterpênicos, taninos e ácidos fenólicos. A quantificação dos ácidos triterpênicos realizada por HPLC-DAD evidenciou uma variação na composição de ácidos triterpênicos entre as espécies e estações do ano. Foi identificada a presença de ácido barbinérvico nas três espécies de Eugenia. Este é o primeiro relato da presença de quantidades significativas do ácido barbinérvico na espécie de E. brasiliensis.

Bolsista: BEATRIZ CARDOSO PESSANHA
Orientador(a): Cristina Henriques
Coorientador(a): Não informado
Resumo: A doença de Chagas é considerada negligenciada, e o benznidazol é a única droga usada no tratamento, causa sérios efeitos colaterais e possui baixa eficácia. Na busca de novos compostos e esquemas terapêuticos são necessários vários testes in vitro e in vivo, entretanto, é fundamental que sejam desenvolvidos métodos rápidos e reprodutíveis de avaliação de compostos, reduzindo os viéses metodológicos relacionados com a contagem de células. Com esse objetivo produzimos cepas de T. cruzi Dm28 geneticamente modificadas (GM), expressando a enzima luciferase (Dm28-Luc) e a proteína fluorescente EGFP (Dm28-EGFP), ferramentas importantes para padronização de novos métodos de análise utilizando novas tecnologias. Primeiramente foram realizados ensaios de padronização do modelo, em linhagem de células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28 GM, para os testes in vitro. Foram determinadas, a quantidade ideal de células LLC-MK2, e as condições de cultivo. As cepas Dm28-Luc, Dm28-EGFP, foram capazes de infectar as células LLC-MK2 e de manter a infecção com o aumento do número médio de amastigotas intracelulares ao longo do tempo, em comparação com a cepa selvagem (Dm28-WT). Utilizando o posaconazol como curva padrão das avaliações dose-resposta, o IC50 para as amastigotas intracelulares em células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28-WT, foi estimado em 1,25 nM por contagem em microscópio óptico e cálculo do índice de infecção. Curvas dose-resposta com posaconazol em leitor de microplaca (luminômetro/flourímetro) para estimar o IC50 em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com T. cruzi GM (Dm28-Luc, Dm28-EGFP) produziram valores de IC50 próximos dos valores estimados por contagem, 1,9 e 1,5 nM para amastigotas de Dm28-Luc e para Dm28-EGFP, respectivamente. Amastigotas da cepa Dm28-EGFP em células LLC-MK2 podem ser de grande auxílio na triagem de compostos pelo leitor de microplaca, assim como para avaliações automatizadas pelo sistema de análise de alto conteúdo (HCS), permitindo o cálculo do índice de infecção e do IC50. As imagens das células e protozoários fluorescentes adquiridas com os filtros FITC, DAPI e Cy3 pela plataforma automatizada de microscópia de fluorescência ImageXpress Micro confocal, e em seguida análisadas de forma automatizada em pipeline customizado pelo software CellProfiler. Pelo método automatizado, em amastigotas de células LLC-MK2 infectadas com Dm28-EGFP o IC50 para posaconazol foi estimado em 1,84 nM, semelhante ao encontrado anteriormente pelos outros métodos. Portanto, as metodologias de avaliação de compostos em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com T. cruzi GM, pelo leitor de microplaca e pelo sistema automatizado HCS, se mostraram apropriadas. O nosso objetivo é de avaliar a atividade de extratos de plantas Piper amalago e Piper glabratum pelo sistema de análise de alto conteúdo (HCS) e leitor de microplaca, utilizando as cepas de T. cruzi geneticamente modificadas, Dm28-EGFP e Dm28-Luc.

Bolsista: Clara Proença Rodrigues Coutinho
Orientador(a): PEDRO PAULO DE ABREU MANSO
Coorientador(a): YULI RODRIGUES MAIA DE SOUZA
Resumo: A febre amarela é uma arbovirose transmitida ao homem mediante a picada de culicídeos, em especial os dos gêneros Aedes spp, Haemagogus sp e Sabethes sp. O agente causador da febre amarela pertence à família Flaviviridae e trata-se de um protótipo do gênero Flavivírus, sendo ele um vírus envelopado de fita simples de RNA de polaridade positiva. A principal forma de prevenção desta doença é através da vacinação em massa da população residente e viajante em áreas endêmicas. A vacina contra febre amarela é composta por vírus atenuados e sua produção é feita pela inoculação da amostra do vírus 17DD em ovos embrionados de Gallus gallus domesticus no nono dia de desenvolvimento. Embora essa vacina seja um exemplo de sucesso, há alguns pontos a serem questionados. Uma alternativa promissora ao modelo já existente consiste na produção desta vacina em cultura de células. Nessa conjuntura, o grupo de pesquisa o qual estou inserida tem desenvolvido pesquisas na tentativa de utilizar células musculares de embriões de galinha para a produção da vacina da Febre Amarela e, nesse contexto, o projeto visa analisar a viabilidade desta produção quanto a quantidade de partículas virais produzidas neste modelo, a manutenção de sua atenuação e imunogenicidade. Por meio desses experimentos, pretendemos determinar se a amostra produzida em cultura de células musculares de embrião de galinha mantém as características da vacina produzida no protocolo convencional. O presente trabalho descreveu as condições ideais de produção da vacina de febre amarela em cultura de células musculares de embrião de galinha, de modo a otimizar a produção do vírus 17DD in vitro. Foi visto por nosso grupo que a infecção em T0 mostrou-se mais vantajosa e a MOI de 0,002 apresentou o maior título viral e, portanto, uma produção mais eficiente. Ademais, os resultados mostraram que na densidade de 7x104 células/cm2 em 48 hpi, a quantidade de vírus produzida é maior em relação a quantidade inoculada e maior que nas densidade 2x105 e 3x104 células/cm2, condições testadas incialmente. Os dados deste trabalho nos permitem concluir que a cultura de células musculares esqueléticas é um bom modelo para o estudo da infecção pelo vírus 17DD, pois apresenta boa reprodutibilidade e sua produção é otimizada através das condições descritas por meio deste estudo. A estabilidade genética das partículas virais produzidas pelas células em cultura foi confirmada pelo sequenciamento do vírus produzido nestas condições experimentais. Desse modo, com base nesses dados obtidos por nosso grupo de pesquisa, o projeto avançou para a experimentação in vivo para a avaliação da atenuação, da imunogenicidade e da proteção dos camundongos C57BL/6 frente ao vírus 17DD in vitro em comparação ao vírus vacinal produzido no protocolo convencional. O presente estudo, portanto, nos leva a perspectiva do desenvolvimento de um método alternativo de produção da vacina baseado em uma plataforma de cultura de células.

Bolsista: Rafaela Caroline Lechtchechen Balduino
Orientador(a): Sheila Cristina Nardelli
Coorientador(a): Caroline de Moraes de Siqueira
Resumo: O Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, uma doença cosmopolita e negligenciada que atinge cerca de ¼ da população mundial, sendo considerada a infecção parasitária mais comum em humanos. No Brasil, essa doença varia de 20-60%, de incidência, dependendo da região, das condições socioeconômicas e culturais. Vale destacar ainda, que no Brasil, os pacientes desenvolvem sintomas mais severos comparados aos indivíduos do Hemisfério Norte, provavelmente devido a uma maior variabilidade genética e maior virulência dos isolados brasileitos. A toxoplasmose é extremamente perigosa quando adquirida durante a gravidez, ou em pacientes imunocomprometidos, podendo resultar em danos severos como malformações congênitas e encefalia. Embora considerada geralmente assintomática em pacientes imunocompetentes, a doença em sua fase crônica tem sido recentemente associada a alterações neurológicas e comportamentais, ressaltando a importância de identificar alvos para o tratamento mais eficiente da toxoplasmose. Nesse contexto, a pesquisa básica focada em componentes essenciais a sobrevivência do parasita, poderia contribuir não somente na compreensão da biologia do parasita, mas também resultar em tratamentos e diagnósticos mais eficientes. Nosso grupo tem focado no estudo das desacetilases de histonas, pelo papel dessas enzimas no silenciamento de genes essenciais para diversos processos do parasita, como virulência, diferenciação e proliferação. As HDACs apresentam uma forte correlação com diversas doenças, incluindo câncer e doenças degenerativas, como Alzheimer. De modo geral, células cancerígenas apresentam alta expressão de HDACs comparadas a células normais e diversos inibidores para essas proteínas têm sido testados com sucesso como tratamento alternativo a quimioterapia tradicional, afetando a proliferação celular, angiogênese, diferenciação e apoptose celular. Em parasitas Apicomplexa, a associação entre HDACs e as doenças por eles causadas foi obtida mais recentemente com a identificação de HDACs como alvo de dois compostos anti-protozoário, apicidina e FR235222, colocando os fatores epigenéticos no centro da busca por alvos quimioterápicos. Toxoplasma possui sete HDACs, com sequencias únicas a alguns membros do filo Apicomplexa. Esse dado ressalta a importância do estudo dessas enzimas, com alto potencial quimioterápico. Toxoplasma é um modelo de estudo que possui diversas ferramentas de genética reversa disponíveis e constantemente aprimoradas, incluindo a manipulação gênica via CRISPR-Cas9 e diversas metodologias para obtenção do nocaute, mesmo no caso de genes essenciais, e tem sido utilizadas com sucesso pelo nosso grupo. Além da manipulação genética, a manutenção e a diferenciação do parasita são relativamente triviais. Dados preliminares obtidos por nosso grupo, revelaram que TgHDAC4 é específica de parasitas Apicomplexa e está localizada no apicoplasto, considerada o “calcanhar de Aquiles” do Toxoplasma. Visto que o apicoplasto apresenta um genoma próprio, é provável que essa HDAC4 atua na manutenção do genoma dessa organela. Esse dado é particularmente interessante, considerando que essa organela é essencial a sobrevivência do parasita. Por outro lado, a TgHDAC2 parece atuar na replicação do DNA, uma vez que parasitas nocaute tem um problema na progressão da fase S, em comparação com o controle, o que resulta em problemas na proliferação e principalmente na virulência dos parasitas nocaute, que resulta em três vezes menos infecção in vitro. Esse projeto visa expandir a caracterização funcional para aTgHDAC5, obtendo seu etiquetamento para obtenção da localização celular. Das HDACs caracterizadas até o momento, apenas a TgHDAC3 está localizada no núcleo, e está envolvida com a regulação da expressão gênica durante a transição das formas taquizoítas para bradizoítas. Acreditamos que a identificação de outras HDACs nucleares podem auxiliar a desvendar o processo de regulação nesse parasita, proporcionando novas perspectivas e sem dúvida, auxiliando na identificação de novos alvos para terapia contra Toxoplasmose, doença de intensa relevância para Saúde Pública no Brasil.

Bolsista: ANDERSON PAULINO DE ARAUJO
Orientador(a): ADA MARIA DE BARCELOS ALVES
Coorientador(a): SIMONE MORAIS DA COSTA
Resumo: A COVID-19 é causada pelo Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2) que levou à pandemia iniciada em 2020. Até o momento foram confirmados 762 milhões de casos com quase 7 milhões de óbitos. O SARS-CoV2 é um vírus de RNA, fita simples e polaridade positiva, cuja partícula viral é constituída de quatro proteínas estruturais: espícula (S), membrana (M), envelope (E) e nucleoproteína (N). A proteína S contém duas subunidades, S1 e S2, sendo que a subunidade S1 contém o domínio de ligação ao receptor (RBD). O RBD interage com receptores presentes na superfície de células humanas, principalmente o receptor ACE2, o que permite a entrada do vírus nestas células. Sendo assim, anticorpos contra a proteína S podem ser neutralizantes, bloqueando a internalização do SARS-CoV2 pelas células hospedeiras e, consequentemente a infecção de novas células. Algumas vacinas contra COVID-19 vêm sendo administradas no mundo, utilizando vírus inativado, RNA ou adenovírus recombinantes, estas duas últimas baseadas na proteína S. No Brasil estão sendo administradas as vacinas Coronavac (Sinovac/Instituto Butantan), que é constituída de SARS-CoV-2 inativado; a ChAdOx1 nCoV-19 (AstraZeneca/Fiocruz), que é baseada em adenovírus de chimpanzé expressando a proteína S de SARS-CoV-2; a Ad26.COV2.S (Janssen Pharmaceutical/Johnson & Johnson), constituída do adenovírus recombinante humano Ad26 expressando a proteína S; e a vacina ComiRNAty (Pfizer/BioNTech), constituída do mRNA que codifica a proteína S. Essas vacinas foram construídas visando prioritariamente a produção de anticorpos neutralizantes (AcN) contra a S. Entretanto, investigações posteriores revelaram o papel também importante da resposta imune celular na proteção e na manutenção de uma resposta duradoura. Alguns estudos vêm demonstrando que a vacina de RNA induz respostas protetoras, com produção de anticorpos neutralizantes e ativação de uma resposta celular robusta. Entretanto, estas vacinas apresentam maior custo de produção e necessitam de estocagem a baixas temperaturas. Neste contexto, as vacinas de DNA representam uma opção vantajosa, pois ativam respostas imunes semelhantes às de RNA, porém são mais baratas e podem ser estocadas à temperatura ambiente. As vacinas de DNA são plasmídeos de expressão em células eucariotas, contendo um ou mais genes de interesse. Após a inoculação da vacina, as células do hospedeiro são transfectadas com os plasmídeos e o RNA mensageiro é transcrito e as proteínas recombinantes então traduzidas. Alguns estudos com vacinas de DNA contra COVID-19 foram reportados e, recentemente, foi aprovada a primeira vacina de DNA para uso em humanos, justamente contra o SARS-CoV2. Entretanto, ainda existem algumas lacunas neste campo de estudo, como por exemplo a utilização de diferentes peptídeos sinais, mutações e outros elementos que podem influenciar na expressão proteica e na magnitude da resposta imune. Vale ressaltar que o grupo trabalha com vacinas de DNA contra outros vírus há muitos anos, em particular contra os vírus Dengue e Zika. Mostramos que duas vacinas de DNA contra dengue geraram altos níveis de proteção em camundongos desafiados com doses letais de Dengue. Também observamos o efeito sinérgico de imunizações combinadas de uma destas vacinas e outra baseada em vírus quimérico Febre Amarela/Dengue na resposta de AcN, com a indução da resposta imune celular primordialmente pela vacina de DNA. Este trabalho gerou patente no Brasil e no exterior. Sendo assim, pretendemos avaliar diferentes vacinas de DNA contra SARS-CoV2 baseadas na proteína S, contendo o seu peptídeo sinal natural ou um peptídeo heterólogo e utilizando a sequência que codifica a proteína completa ou fragmentos desta. Estas construções foram inicialmente avaliadas in vitro quanto à eficiência da expressão das proteínas recombinantes, em cultura de células transfectadas. Posteriormente, as melhores construções serão testadas in vivo.

Bolsista: SAMUEL DE SOUSA FERREIRA
Orientador(a): MARIA CRISTINA SOARES GUIMARAES
Coorientador(a): JANIO GUSTAVO BARBOSA
Resumo: A proposta aqui apresentada visa aprimorar e ampliar a estruturação da pesquisa sobre formação de bases de dados sobre judicialização da saúde e está orientado para a construção e disponibilização de bancos de dados mais acurados, sobre a judicialização da saúde em câncer. Parte desse esforço já se encontra organizado, tratado e disponível no período de 2015 a 2021, para o Estado do Rio de Janeiro, dentro de uma infraestrutura de informação batizada de JUDJe (www.judje.link ), cujos projetos de iniciação cientifica anteriores deram apoio e suporte a parte do seu desenvolvimento. Nas fases anteriores, o trabalho centrou-se na montagem de banco de dados sobre processos judiciais em saúde, com estruturação, reconhecimento e montagem de categorias classificadoras das ações em câncer, a fim de coletar os dados dos DJe (Diários de justiça eletrônico), capturando as movimentações judiciais de forma automatizada. Na segunda fase, o foco da pesquisa esteve na análise e desenvolvimento descritores e termos mais adequados e aderentes para recuperação da informação (RI), o que conduziria ao processo de KD (knowledge discovery): identificação das movimentações judiciais em câncer, juntamente com suas características definidoras. Uma vez coletados os DJe, o trabalho focou-se em encontrar dados de saúde em câncer e registros de processos judiciais de saúde, fazendo uso de ontologias e descritores específicos, tanto categóricos como os derivados de análises morfossintática e semântica. Na presente fase, o objetivo é capturar os dados de judicialização da saúde a partir dos contextos de ocorrência, com ênfase está na pesquisa e no estudo dos dados geoterritorializados. De fato, dentre os inúmeros problemas que os dados judiciais possuem, um deles é o da geoterritorialização. Não se sabe, na atualidade, a relação entre as ocorrências dos processos e as ocorrências dos serviços requisitados nas ações judiciais, e quais as consequências desse fluxo no território. Identificada essa relação, a expectativa é que seja possível gerar bancos de dados infra estruturais, triangulando a ocorrência do litígio com a oferta de serviços de saúde no território, algo ainda inédito nos tipos de bancos abertos sobre o tema. Se exitosa, tal metodologia de geoterritorialização dos litígios em saúde poderá ampliar as dimensões de análises sobre a judicialização da saúde. Assim, a expectativa é que o resultado da pesquisa poderá prover alguns indícios do como os processos de adoecimento estão relacionados ao território (quer seja por limitação de acesso, quer seja por ausência de assistência adequada, dentre inúmeros outros fatores), particularmente aqueles territórios vinculados às regiões de saúde.