Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: GEOVANA ESPINDOLA JARDIM
Orientador(a): Robson Xavier Faria
Coorientador(a): Não informado
Resumo: O receptor purinérgico P2X7 é um canal ativado fisiologicamente pela adenosina 5’-trifosfato (ATP) extracelular e está distribuído amplamente em mamíferos, incluindo células de linhagem hematopoiética, como macrófagos e micróglias. Uma breve exposição ao ATP extracelular permite que cátions, como Ca2+, Na+ e K+, passem pela membrana. Uma estimulação prolongada induz a formação de um poro permitindo a entrada de moléculas de até 900 Da, como corantes orgânicos. Além disso, o P2X7 é responsável por regular eventos celulares, incluindo liberação de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-1? (IL-1?), IL-6, TNF-? e a morte celular. Uma vez liberadas, essas citocinas desempenham papel como mediadores intracelulares de geração e controle de resposta imune e inflamatória. Nesse contexto, estudar o funcionamento do P2X7 torna-se limitado pela falta de antagonistas seletivos com potente atividade in vitro e in vivo nos modelos animais e propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas apropriadas em humanos, que demonstrem efeito superior à droga de referência em ensaios clínicos. De fato, as substâncias estudadas até o momento, por outros grupos científicos e indústrias farmacêuticas, falharam essencialmente em ensaios clínicos para a artrite reumatoide. Em trabalhos anteriores do nosso grupo, após uma triagem, foram selecionados naftoquinonas, ácido borônicos e triazóis e pirazóis que apresentaram inibição do P2X7, com IC50 na faixa de nanomolar, sem toxicidade celular após 72h de exposição, CC50 acima de 100 micromolar, e redução da inflamação no modelo de edema de pata. Neste trabalho, daremos continuidade ao estudo desses compostos, in vivo, avaliando a atividade anti-inflamatória no modelo de peritonite induzida pela carragenina em camundongos. Três naftoquinonas (N1, N2 e N3), 4 ácidos borônicos (AB1, AB2, AB3 e AB4), 3 triazóis (T1, T2 e T3) e 6 tiadiazóis TI1, TI2, TI3, TI4, TI5 e TI6) serão estudadas quanto a capacidade de reduzir a migração de células inflamatórias no modelo de peritonite induzida por carragenina. Usaremos este modelo para verificar se antagonistas seletivos para este receptor são capazes de reverter uma reposta inflamatória causada por um mediador geral, como a carragenina. Todos os compostos terão suas atividades comparadas ao Brilliant Blue G (BBG), um antagonista do receptor P2X7R e da dexametasona. Adicionalmente, investigaremos a toxicidade aguda em dose única destas substâncias. A atividade das substâncias nestes protocolos é um alicerce para se expandir os estudos em modelos experimentais de sepse, inflamação crônica, como o da artrite reumatoide induzida por colágeno, e outros testes de toxicidade.

Bolsista: GABRIEL CARVALHO DO NASCIMENTO
Orientador(a): ADEMIR DE JESUS MARTINS JUNIOR
Coorientador(a): CARLUCIO ROCHA DOS SANTOS
Resumo: A resistência a inseticidas (RI) é uma ameaça ao controle de insetos vetores, em escala global. Temos alcançado importantes avanços na investigação de alterações fisiológicas selecionadas para o fenótipo da resistência, que contribuem para a vigilância e monitoramento da RI em populações naturais. Entre as alterações conhecidas para a RI em Aedes aegypti, vetor de arbovírus, as mutações kdr, que conferem resistência ao efeito knockdown dos piretroides, são as que vem sendo mais amplamente estudadas e documentadas. A RI, seja por kdr ou outro mecanismo, geralmente acarreta um custo no fitness do inseto em ambientes livres de inseticida. Uma das hipóteses mais aceitas é que tais efeitos deletérios aconteçam porque as alterações para a RI requerem uma alta quantidade de energia, que naturalmente seria utilizada para funções normais do inseto. Neste projeto, estamos investigando se populações de Ae. aegypti com diferentes níveis de RI, bem como linhagens com diferentes genótipos kdr, quando mantidas em laboratório sob as mesmas condições ambientais, apresentam concentrações distintas de macromoléculas enérgicas, como proteínas, carboidratos, glicogênio e lipídeos. Até então mostramos que, no geral, larvas destas populações e linhagens apresentaram concentrações semelhantes. Precisamos finalizar as análises de lipídeos, e realizarmos ensaios similares com mosquitos adultos. Além disso, incluiremos populações de diferentes regiões geográficas do país, independente de seus perfis de RI, a fim de testarmos se a variável origem geográfica, com mosquitos provenientes de biomas distintos, contribuirá com diferenças na composição daquelas moléculas energéticas.

Bolsista: LAURA DE OLIVEIRA BORGES
Orientador(a): VALERIA CAVALCANTI ROLLA
Coorientador(a): FLAVIA MARINHO SANTANNA
Resumo: Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa cujo agente etiológico é um bacilo álcool-ácido resistente (BAAR), denominado Mycobacterium tuberculosis (MTB). O diagnóstico inicial de TB é obtido através de achados clínicos e radiológicos e confirmado a partir da realização de exames tais como a baciloscopia e a cultura (este último considerado padrão-ouro) preconizados pelo Ministério da Saúde para confirmação de casos de TB (BRASIL, 2008). Após décadas de estagnação no campo diagnóstico avanços surgiram a partir de 2010 com os testes rápidos moleculares. TUBERCULOSE CUTÂNEA - TB cutânea é uma forma extrapulmonar considerada rara. Apenas 14% dos diagnósticos de TB são da forma extrapulmonar sendo, 1-2% na forma cutânea (PACHECO et al., 2015). O diagnóstico de TB cutânea é feito pela baciloscopia (BAAR em exame direto), que apesar de simples e rápida tem rendimento baixo, ou por meio de cultura (em meio sólido ou líquido) ou a presença do granuloma com necrose caseosa no fragmento de biopsia, cujo rendimento varia muito (BRASIL, 2008) e é menor que 10% (ZHANG, 2016) A cultura do material biológico em meios sólidos utiliza meios como Löwenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh. O tempo de detecção do crescimento varia de 14 a 30 dias, podendo se estender por até 8 semanas. Entretanto, o isolamento de MTB na cultura de lesões cutâneas é baixo (23%), (BRASIL, 2011). O Xpert® MTB/RIF é um teste de amplificação de ácidos nucleicos utilizado para detecção do complexo MTB e resistência a rifampicina. A sensibilidade do teste em amostras respiratórias com resultado de baciloscopia positivo varia de 98% a 100%, porém, o teste foi capaz de detectar até 78% dos casos negativos à baciloscopia. A especificidade do teste, pode variar de 90,9% a 100% em relação à cultura (VAN RIE et al., 2010). Atualmente, o teste Xpert® MTB/RIF foi substituído pelo Xpert® MTB/RIF Ultra com um limiar menor para detecção de MTB e maior especificidade em relação à resistência podendo ser utilizado em vários espécimes clínicos incluindo a pele (DORMAN et al., 2018) . JUSTIFICATIVA O avanço na tecnologia permitiu o desenvolvimento de ferramentas com maior capacidade diagnóstica, em especial testes rápidos moleculares. Após o surgimento do Xpert® MTB/RIF Ultra alguns estudos comparando a performance do Xpert® MTB/RIF e do Xpert® MTB/RIF Ultra em diferentes espécimes clínicos mostraram uma maior sensibilidade e especificidade do Ultra (CHAKRAVORTY et al., 2017) que passou a ser usado na rotina diagnóstica de muitos centros de pesquisa Um estudo de coorte desenvolvido no Laboratório de Pesquisa Clínica em Micobaceterioses denominado “Fatores determinantes da sobrevida em indivíduos com tuberculose infectados ou não por HIV” está em andamento e inclui TB em qualquer de suas formas clínicas, com informações sobre o diagnóstico dos diversos casos. Não existe até o momento estudos com Xpert®MTB-RIF e Xpert®ULTRA abordando as diversas apresentações de TB cutânea. A revisão destes casos pode ser especialmente interessante e detalhada para avaliação dos testes no diagnóstico de TB cutânea. OBJETIVO : Avaliar a performance do teste Xpert® MTB/RIF e do Xpert® MTB/RIF Ultra no diagnóstico da TB extrapulmonar forma cutânea comparado com o resultado de cultura. PACIENTES E MÉTODOS Estudo de coorte retrospectivo com dados secundários coletados do estudo no Laboratório de Pesquisa Clínica em Micobacterioses (LAPCLIN/TB) do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI) FIOCRUZ, Rio de Janeiro. Todos os pacientes com TB cutânea com diagnóstico clínico, laboratorial (baciloscopia e/ou, cultura e/ou histopatológico) no período de janeiro de 2014 a dezembro de 2021. Estima-se uma casuística de 30 pacientes. Serão incluídos todos os casos de TB cutânea registrados no estudo de sobrevida. Serão excluídos os casos sem dados de Xpert®. A coleta dos dados dos pacientes ocorrerá através da revisão de prontuários de casos de TB cutânea registrados no banco de dados do estudo. Os resultados de exames serão captados através do prontuário eletrônico do INI. Um banco de dados será construído no programa Excel versão 2013. As análises serão feitas no programa SPSS versão 2013. O projeto de pesquisa utilizará dados obtidos do estudo “fatores determinantes da sobrevida em indivíduos com TB infectados ou não por HIV” que foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa, do INI, e recebeu o número 002/00.

Bolsista: GABRIELA BRAGA SOUZA
Orientador(a): INGO RIEDERER
Coorientador(a): Rafaella Ferreira Reis
Resumo: A utilização de células-tronco para o tratamento de lesões ou doenças degenerativas esbarra em diversos desafios, como a reprodutibilidade em ensaios clínicos. De fato, a capacidade regenerativa das células-tronco adultas depende do microambiente local, que pode direcionar o processo de regeneração à deposição exacerbada de matriz extracelular e culminar em disfunção tecidual. No músculo, células-tronco denominadas de células satélites ficam localizadas entre a membrana da fibra muscular e a membrana basal que envolve essa estrutura. Elas ficam em estado de quiescência, podendo ser ativadas após lesão ou trauma. Parte delas volta a apresentar características estaminais (autorrenovação), enquanto a outra parte (denominada de mioblastos) prolifera e pode se diferenciar para formar novas fibras musculares ou recuperar as fibras danificadas. Nesse contexto, os macrófagos, através de citocinas liberadas exercem um papel central para o sucesso regenerativo. O GDF11 faz parte da família do TGF-?, e dois membros dessa família, TGF-? e Miostatina (GDF8), tem papel fundamental, e bem documentado, na regeneração muscular esquelética, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas1. Foi sugerido que GDF11 poderia atuar como uma molécula rejuvenescedora, sendo capaz de reverter a hipertrofia cardíaca relacionada à idade2, além de restaurar a integridade genômica das células satélites envelhecidas no músculo esquelético3. Porém, estudos mais recentes mostram um papel controverso de GDF11, que poderia prejudicar a regeneração muscular e causar um aumento significativo do conteúdo de colágeno no músculo4,5,6. Nossos resultados mostram que GDF11 inibe a diferenciação e fusão de mioblastos humanos, mas é capaz de estimular a proliferação dos mioblastos. Nosso grupo demonstrou que estimular a proliferação, consequentemente retardando a diferenciação, melhorava a capacidade regenerativa de células progenitoras musculares humanas (mioblastos) transplantados em camundongos imunodeficientes7. Um dos objetivos do projeto principal é desenvolver um peptídeo otimizado de GDF11 que poderia promover uma melhor regeneração muscular, ao por exemplo, estimular a proliferação sem prejudicar a capacidade de fusão dos mioblastos. Nesse contexto é importante identificar quais células produzem GDF11 e expressam seus receptores, e que tipo de resposta celular ocorre dessa interação. Objetivos: 1) Identificar a expressão de GDF11 e seus receptores (ALK4, 5 e 7) em músculos de camundongos após lesão muscular; 2) Realizar o screening de mioblastos nocautes para ALK5 (ALK4 e 5 realizados), e analisar a proliferação, diferenciação e fusão do clone selecionado Metodologia: Imunofluorescência: músculos tibialis anterior (TA) de camundongos C57BL/10 lesionados por cardiotoxina foram coletados e parte processados com as lâminas armazenadas. Nos pontos da cinética de 24h, 72h, 5, 10 e 21 identificaremos por imunofluorescência a expressão de GDF11 e seu receptores em macrófagos, células satélites, mioblastos e fibras musculares. Screening de mioblastos (CL25) nocautes para ALK5 (ALK5-KO): Nós produzimos os vetores de expressão CRISPR/Cas9, eletroporamos, fizemos o enriquecimento das células GFP positivas e as colocamos em diluição limitante para selecionarmos os clones. A avaliação da especificidade e a eficiência da clivagem dos clones selecionados será realizada por PCR e posterior sequenciamento para confirmação e caracterização das alterações indels (inserções/deleções). Avaliação da proliferação e diferenciação do clone mutante para ALK5: mioblastos humanos da linhagem CL25, mutantes e WT serão cultivados em meio de proliferação ou diferenciação. Ensaios de incorporação de EdU e contagem celular avaliarão a proliferação, enquanto a diferenciação será avaliada pelo índice de fusão e quantificação do número e espessura dos miotubos, bem como o número de núcleos por fibra muscular revelados por DAPI e imunomarcação contra miogenina e cadeia pesada de miosina.

Bolsista: MAYRA VIEIRA FERREIRA
Orientador(a): CONSTANCA CLARA GAYOSO SIMOES BARBOSA
Coorientador(a): IRIS EDNA PEREIRA DA SILVA
Resumo: Nas áreas rurais de Pernambuco, as doenças parasitárias são prevalentes em locais com baixa cobertura de saneamento onde a esquistossomose é transmitida pela contaminação fecal das coleções hídricas especialmente em localidades situadas em territórios desprovidos de atenção em saúde. As comunidades quilombolas mantêm forte vínculo com o meio ambiente estando situadas em áreas rurais distantes, o que dificulta o acesso aos serviços de saúde, condicionando a manutenção de doenças. Pernambuco não tem estudos relacionados a parasitoses nas 149 Comunidades de Quilombos (CRQs) registradas pela Fundação Cultural de Palmares (2022). Assim, este estudo se justifica pela importância de se desvendar a epidemiologia de doenças parasitárias, em ambientes insalubres a exemplo da comunidade quilombola de Trigueiros, situada no município de Vicência, considerada vulnerável por apresentar condições de saneamento insuficientes e precariedade no acesso a saúde. Objetivo Geral: Avaliar as condições biológicas, ambientais e sanitárias relacionadas a transmissão da esquistossomose e geo-helmintoses na comunidade quilombola Trigueiros, Vicência, Pernambuco. Objetivos específicos e metodologias 1. Identificar e mapear as coleções hídricas locais. Será realizado o mapeamento georreferenciado da localidade através de receptor GPS cujos dados serão ajustados através do software TrackMaker e os arquivos (mapa da localidade, distribuição de casos, criadouros e focos) salvos para a análise espacial dos dados pelo software QGis 3.16 e posterior confecção dos mapas temáticos. 2. Realizar inquérito malacológico para verificar a positividade para S. mansoni nos vetores Biomphalaria e identificar focos de transmissão. Será realizada busca ativa de moluscos vetores nas coleções hídricas locais pela técnica Olivier; Schneiderman (1956). Os caramujos serão transportados ao laboratório para (1) identificação da espécie através da Técnica de Dissecção da genitália; (2) exame pela técnica de exposição à luz para a eliminação de cercárias de S. mansoni e (3) exame de diagnóstico molecular para detectar a presença do DNA do S. mansoni nos moluscos. 3. Realizar inquérito parasitológico para diagnosticar a prevalência da esquistossomose e Geo-helmintoses na comunidade do estudo. Será realizado um inquérito censitário coproscópico com cadastramento dos indivíduos da comunidade. O diagnóstico parasitológico das fezes será feito pelo método Kato-Katz que permite quantificar a carga parasitária dos indivíduos doentes e diagnosticar outros helmintos além do Schistosoma. 4. Análise dos dados. As análises estatísticas descritivas (média, desvio padrão, distribuição das frequências) relacionadas aos casos serão feitas através do software EpiInfo. As análises espaciais serão realizadas no software QGis 3.16 pelo estimador de intensidade kernel para construção de mapas mostrando a distribuição espacial das parasitoses, os focos de esquistossomose e os ambientes de risco para a transmissão.

Bolsista: GABRIELA MORESCHI DE ALMEIDA
Orientador(a): MARIANA ROCHA DAVID
Coorientador(a): Não informado
Resumo: Uma vez que ainda não há vacinas amplamente disponíveis contra arbovírus que acometem po-pulações humanas, a principal maneira de evitar a sua transmissão é controlar os mosquitos vetores. As epidemias recentes de dengue, Zika e chikungunya demonstram que os métodos tradicionais de controle de Aedes aegypti, eliminação de criadouros larvares e uso de inseticidas, apresentam efetividade limitada. Deste modo, é urgente o desenvolvimento de novas metodologias para reduzir a transmissão destes patógenos. Neste cenário, a exploração da capacidade inata de alguns simbiontes para limitar a competência vetorial de mosquitos a arbovírus ou a modificação genética destes microrganismos para expressar moléculas capazes de produzir tal efeito (paratransgênese) surgem como uma alternativa. Nos últimos anos, a microbiota intestinal de Ae. aegypti foi identificada através de metodologias dependentes e independentes do cultivo bacteriano e seu efeitos na fisiologia e competência vetorial deste mosquito foram descritos, indicando possíveis bactérias candidatas à aplicação na redução da transmissão de arbovírus, como Asaia, Chromobacterium, Proteus e Paenibacillus. Neste sentido, ainda é necessário caracterizar a interação microbiota-hospedeiro para estes e outros simbiontes intestinais de Ae. aegypti, desvendando meios de aquisição e transmissão horizontal/vertical, localização em tecidos do hospedeiro, capacidade de espalhamento em populações do vetor, fatores genéticos essenciais para a colonização do hospedeiro e receptividade à manipulação genética. Recentemente, um estudo demonstrou que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser aplicado para modificar geneticamente simbiontes intestinais de Aedes com o intuito de investigar as relações microbiota-hospedeiro. Assim, a integração de genes de marcação fluorescente nestes simbiontes pode revelar padrões de colonização de tecidos e transmissão vertical e horizontal. Além disso, a possibilidade de deletar e integrar genes em bactérias da microbiota sem comprometer o seu fitness é essencial para o desenvolvimento de abordagens de paratrangênese. Assim, este subprojeto tem como objetivos (a) realizar uma revisão bibliográfica acerca da competência vetorial de populações brasileiras de Ae. aegypti ao dengue e (b) selecionar e caracterizar geneticamente simbiontes intestinais de Ae. aegypti para futura aplicação do sistema CRISPR/Cas9, visando o estudo das relações hospedeiro-microbiota neste vetor. Para tal, Aedes aegypti adultos serão coletados com aspiradores no Rio de Janeiro. Após agrupados por ponto e data de coleta, fêmeas terão a superfície externa esterilizada em etanol 70% e lavada em tampão fosfato salino estéril (PBS). O intestino médio será removido e macerado em PBS. Cada amostra será diluída serialmente e plaqueada em meio de cultura LB-agar e Triptona de Soja Agar (TS-agar) em temperatura ambiente (~28ºC). Nas 72 h seguintes, as colônias bacterianas serão preservadas a -70ºC. O DNA das bactérias isoladas será extraído para amplificação e sequenciamento (Sanger) do gene 16S rRNA (>1000 pb) utilizando iniciadores universais para identificação taxonômica no programa Ribossomal Data Pro-ject Classifier. Será selecionada ao menos uma bactéria candidata, de gêneros frequentemente encontrados na microbiota de Ae. aegypti, a qual terá o genoma sequenciado em Illumina MiSeq (2x250bp paired-end). A montagem e anotação do genoma será feita utilizando o MIRA versão 4.0 e o pipeline RAST, respectivamente, seguidas por curadoria manual. A partir destes dados serão selecionados genes conservados para nocaute e regiões intergênicas para inserção de genes de marcação fluorescente via CRISPR/Cas9.