Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: MARIA MIKAELY RIBEIRO BRITO
Orientador(a): OTACILIO DA CRUZ MOREIRA
Coorientador(a): Paula Finamore Araujo
Resumo: Até o presente momento, não se tem vacina profilática ou terapêutica aprovada para a doença de Chagas. O atual tratamento etiológico, empregando o fármaco Benznidazol, tem se mostrado eficiente na fase aguda da infecção (60 - 85% da taxa de cura), embora seu uso na fase crônica ainda seja debatido. O padrão ouro para avaliação da eficácia terapêutica é a soroconversão de testes sorológicos convencionais, que podem levar anos ou décadas para serem alcançados. Assim, o desenvolvimento de marcadores para medir respostas terapêuticas em pacientes infectados com Trypanosoma cruzi é atualmente objeto de intensa pesquisa. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs pequenos, de fita única, não-codificantes, que agem na regulação da expressão de RNA mensageiro alvo. Muitos patógenos, incluindo vírus, bactérias e protozoários, são capazes de manipular as redes de miRNA de células hospedeiras infectadas. Estudo prévio do nosso grupo, com microRNAoma no tecido cardíaco de camundongos infectados cronicamente com T. cruzi, analisou 641 alvos para miRNA de camundongos tratados ou não com benznidazol na fase crônica da doença experimental. Dentre estes alvos, destacou-se o miRNA-146b-5p. Em experimento confirmatório, este miRNA apresentou um nível de expressão de 1,48±0,69 no grupo não infectado, 3,92±0,97 no grupo infectado e 0,56±0,19 no grupo tratado, em animais que foram eutanasiados 30 dias após tratamento. Diante disso, formulamos a hipótese de que este miRNA poderia ser um biomarcador de resposta terapêutica ao tratamento com benznidazol. Para testá-la, pretendemos avaliar os níveis de miRNA-146b-5p no sangue de 99 pacientes crônicos oriundos do Brasil antes e em até um ano após o tratamento com benznidazol. A confirmação deste miRNA como biomarcador de resposta terapêutica abriria possibilidades para o teste de novas drogas ou esquemas terapêuticos, podendo vir a ser grande avanço para o tratamento da doença de Chagas.

Bolsista: JOANA RIBEIRO CARRILHO ROCADO
Orientador(a): JOANNA REIS SANTOS DE OLIVEIRA
Coorientador(a): ALDA MARIA DA CRUZ
Resumo: A maioria dos casos de coinfecção Leishmania/HIV nas Américas ocorre no Brasil, onde a leishmaniose visceral (LV) aparece como a forma prevalente no que se refere à coinfecção. A infecção pelo HIV-1 e pela Leishmania infantum são caracterizadas por uma imunossupressão e uma intensa ativação celular crônica. Estudos anteriores de nosso grupo já demonstraram que a leishmaniose é um cofator para o aumento do grau de ativação em pacientes coinfectados com HIV. Essa intensa ativação imune pode afetar a função efetora dos linfócitos T quantitativamente e funcionalmente, o que pode contribuir para as frequentes recidivas da LV em pacientes HIV+. Em consequência do status imune ativado na infecção pelo HIV verifica-se uma aceleração da imunosenescência, caracterizado por uma exaustão dos recursos imunes primários. Neste cenário, a imunosenescência pode ser agravada na coinfecção com a LV, já que esta também cursa com um comprometimento sistêmico e ativação celular. Desse modo, nosso objetivo é avaliar prospectivamente parâmetros imunológicos que possam contribuir para o prognóstico e grau de comprometimento imune dos pacientes coinfectados a fim de entender/predizer as recidivas de LV. Tais parâmetros incluiriam a ativação celular, senescência e diferenciação linfocitária (células T de memória e reguladoras) nas células do sangue de pacientes coinfectados estimulados com os antígenos parasitários, além da capacidade proliferativa e de produção de citocinas. Serão estudados 27 pacientes LV/HIV, acompanhados prospectivamente desde a fase ativa da LV até seis meses pós-tratamento (3 visitas). Como controles, estudaremos indivíduos portadores de LV negativos para o HIV (n= 10) e indivíduos saudáveis para ambas as infecções (n= 10). Os níveis de linfócitos T por mm3 (CD3+/CD4+, CD3+/CD8+) serão quantificados no sangue. A avaliação funcional será realizada pela fenotipagem de moléculas associadas com ativação (CD38 e HLA-DR), senescência replicativa (CD57/CD28) e diferenciação (CD45RA/CCR7) após estimulação in vitro por citometria de fluxo. A capacidade proliferativa será medida através da incorporação de BrdU nas células em divisão. Os resultados obtidos serão correlacionados a parâmetros clínicos e laboratoriais utilizados no acompanhamento desses pacientes (contagens de linfócitos T CD4+, carga viral e carga parasitária). Este estudo ajudará a entender se a intensa ativação imune, observada nesses indivíduos coinfectados, capaz de prejudicar a reconstituição imunológica pode estar contribuindo para acelerar o processo de senescência replicativa, bem como influenciando negativamente a resposta imune de memória específica em pacientes coinfectados. Tal investigação poderá trazer possíveis parâmetros laboratoriais de acompanhamento desses pacientes quanto à manutenção da remissão clínica ou mesmo para uma reativação da LV.

Bolsista: Graciele Maria dos Santos
Orientador(a): ELEN MELLO DE SOUZA
Coorientador(a): Não informado
Resumo: A infecção pelo vírus zika (ZIKV) em mulheres grávidas está associada a uma variedade de defeitos congênitos incluindo microcefalia, calcificações intracranianas, doença ocular, déficits auditivos, restrição de crescimento intrauterino e aborto espontâneo, coletivamente denominada síndrome congênita do Zika (SCZ). Estudos demonstraram que o genoma do ZIKV foi detectado no líquido amniótico e no cérebro fetal, confirmando que o vírus atravessa a barreira placentária. No entanto, as alterações funcionais que ocorrem na interface materno-fetal e contribuem para o desenvolvimento da patogênese fetal não estão caracterizadas. Neste estudo, será investigado o quanto a infecção pelo ZIKV altera a funcionalidade de células da placenta humana em cultivo ex vivo e in vitro, através da avaliação dos parâmetros fisiológicos de: i) proliferação; diferenciação e invasão de trofoblastos de 1° trimestre, e ii) secreção dos hormônios e peptídeos tais como, estradiol; progesterona; lactogênio placentário humano (hPL); gonadotrofina coriônica humana (b-hCG); fator de crescimento placentário (PlGF); fosfatase alcalina placentária (PLAP) e antígeno leucocitário humano G1 (HLA-G1). Assim, pretendemos elucidar o envolvimento de mecanismos morfofisiológicos e endocrinológicos na possibilidade de infecção intrauterina pelo ZIKV e contribuir para a geração de conhecimento relacionado aos aspectos da patogenia do ZIKV na interface materno-fetal.

Bolsista: JOANA MARIA RODRIGUES SIQUEIRA
Orientador(a): MARIA LUCIANA SILVA DE FREITAS
Coorientador(a): ADRIANO GOMES DA SILVA
Resumo: A imunopatogênese da leishmaniose visceral (LV) ativa é caracterizada por uma imunossupressão em paralelo a uma ativação imune sistêmica. Ambos os mecanismos podem contribuir para um comprometimento da resposta efetora específica ao parasito, impactando negativamente na evolução clínica dos pacientes. De fato, o status inflamatório exacerbado já foi associado à evolução para LV grave, onde altos níveis de citocinas inflamatórias precederam o óbito de pacientes com LV ativa, e se correlacionaram com parâmetros clínico-laboratoriais associados à gravidade. A literatura acerca dos fatores imunológicos que possam predizer tais desfechos é vasta. No entanto, as recidivas têm emergido como um desafio clínico adicional na LV e ainda pouco se investiga sobre os parâmetros imunológicos subjacentes. Nesse cenário, o grau de ativação de linfócitos T pode ser determinante para a senescência replicativa, que resulta no acúmulo de células T terminalmente diferenciadas, caracterizadas por uma deficiência na proliferação, produção de citocinas, e que podem ser identificados por marcadores fenotípicos. Assim, nossa hipótese é que o prejuízo imune da fase ativa da LV, ao lado das consequências do elevado grau de ativação, como a senescência replicativa, podem comprometer a qualidade da resposta efetora ao parasito e predispor às recidivas da LV. No contexto da coinfecção LV/HIV, nosso grupo verificou que pacientes com recidivas da LV (-R: recidivantes) mantiveram percentuais elevados de linfócitos T ativados ex vivo, diferente daqueles com primodiagnóstico da LV (-NR: não-recidivantes) que reverteram estes parâmetros a níveis próximos da normalidade. Além disso, os percentuais de células T senescentes foram elevados nos pacientes LV/HIV. Assim, acreditamos que, mesmo entre os não-coinfectados, a não-responsividade de clones específicos aos antígenos de Leishmania, em conjunto à morte celular induzida por ativação na periferia podem ajudar a explicar a perda do controle parasitário e a progressão para recidivas. Espera-se encontrar parâmetros imunológicos que possam ajudar a predizer esse prognóstico. Para confirmar tal hipótese, 30 pacientes com LV serão agrupados em -NR e -R, e acompanhados desde a fase ativa até 12 meses pós-tratamento. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) serão obtidas por gradiente de centrifugação em Ficoll-Hypaque, criopreservadas e, posteriormente, descongeladas para estímulo in vitro frente aos antígenos de L. infantum. Após, parâmetros fenotípicos e funcionais em termos de senescência, ativação, proliferação e produção de citocinas intracelulares serão avaliados por citometria de fluxo multiparamétrica. Os resultados mais recentes são provenientes de experimentos de padronização da estimulação in vitro com os antígenos parasitários, seguido de imunofenotipagem extracelular e intracelular para a avaliação dos perfis fenotípicos propostos. Obteve-se sucesso na padronização, sobretudo, nas análises de proliferação celular pela marcação do BrdU, que foi confirmada pelo estímulo com mitógeno Concanavalina A. Finalmente, embora o n de pacientes seja pouco expressivo, a padronização foi efetiva em relação aos demais perfis avaliados, sendo possível estabelecer uma estratégia de análise bem definida.

Bolsista: Gabriela Louise da Silva Moreira
Orientador(a): CLAUDIA MAGALHAES CALVET ALVAREZ
Coorientador(a): Não informado
Resumo: Justificativa e Relevância. O tratamento da doença de Chagas é limitado às drogas benzonidazol e nifurtimox, que apresentam eficácia variável na fase crônica da infecção e causam severos efeitos colaterais tóxicos. Assim, a busca por drogas mais efetivas e menos tóxicas continua sendo um desafio atual. Derivados de piperina e butenolídeos, compostos sintetizados a partir de produtos naturais, mostraram atividade tripanocida promissora e merecem avançar no pipeline de desenvolvimento de drogas1,2. Em paralelo, o composto SRPIN340 e derivados, inibidores seletivos de quinase serina-arginina 1/2, são candidatos para serem avaliados contra o T. cruzi, que possui enzimas análogas à quinase alvo dos compostos3. Esses inibidores de quinases também têm potencial de desempenhar atividade dual e proteger o miocárdio durante a infecção, já que relatos anteriores mostraram que a SRPIN340 evitou danos oxidativos em cardiomiócitos e músculo cardíaco de ratos4. Além disso, estresse oxidativo5 e a infecção pelo T. cruzi 6 levam à acumulação de matriz extracelular em fibroblastos cardíacos. Assim, o inibidor SRPIN340 e derivados também podem interferir no processo de fibrose cardíaca, condição incapacitante da fase crônica da doença de Chagas. Objetivos. Avaliar a atividade tripanocida de derivados de piperina, butenolídeos e SRPIN340; investigar se SRPIN340 e derivados protegem cardiomiócitos dos danos oxidativos causados pelo T. cruzi; analisar se SRPIN340 e derivados possuem atividade anti-fibrótica em fibroblastos cardíacos infectados pelo parasita. Metodologia. Triagem de atividade tripanocida – Formas tripomastigotas de T. cruzi Dm28c luc e células Vero infectadas pelo mesmo clone serão tratadas com derivados de piperina, butenolídeos e SRPIN340 por 24h e 72h, respectivamente, e a viabilidade dos parasitas avaliada pela adição de luciferina e leitura de luminescência7; Ensaios de washout- Culturas de vero infectadas com T. cruzi Dm28c luc serão tratadas com os compostos por 72h e depois os compostos serão removidos para avaliar a ressurgência de parasitas após 3 dias por detecção luminescente7; Análise de dano oxidativo-Culturas primárias de cardiomiócitos murinos serão infectadas e tratadas com SRPIN340 e derivados. A produção de espécies reativas de oxigênio será medida por reagente de Griess e através de microscopia de fluorescência com o corante MitoSOX Red (Invitrogen). Quantificação de colágeno- – Culturas de fibroblastos cardíacos murinos derivados de cultivo primário, infectadas pelo T. cruzi, serão tratadas com SRPIN340 e derivados. As culturas serão fixadas e coradas com corante Sirius Red/Fast Green por 2h, o que permite a medida semiquantitativa do conteúdo de colágeno e proteínas não colágenas em cultura8. Após lavagem, o corante é extraído das células com solução de NaOH 0,1 N /Metanol 1:1. As absorbâncias dos sobrenadantes resultantes serão lidas no leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices) a ? 540 e 605 nm8; Referências Bibliográficas. 1. Franklim, T. N. et al. Molecules 18, 6366 (2013) 2. Conserva, G. A. A. et al. Phytomedicine 54, 302(2019) 3. Portal, D. et al. Molecular and Biochemical Parasitology 127, 9 (2003). 4. Huang, J. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 510, 97 (2019). 5. Philip, J. L. et al. Disease Models & Mechanisms 8, 1579 (2015). 6. Silva, T. A. et al. International Journal of Molecular Sciences 20, (2019). 7. Orlando, L. M. R. et al. Molecules 26, (2021). 8. Houghton, P. E. et al. Wound Repair and Regeneration 4, 489–495 (1996).

Bolsista: Maria Gabriela Sarah Santos
Orientador(a): Milena Botelho Pereira Soares
Coorientador(a): BRENO CARDIM BARRETO
Resumo: A cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) é uma doença debilitante de curso fatal, sendo as arritmias cardíacas a principal causa de morte súbita dos pacientes acometidos pela doença. Este prognóstico obscuro agrava-se em indivíduos acometidos por insuficiência cardíaca grave decorrente da CCC para os quais a única opção terapêutica definitiva é o transplante cardíaco, procedimento complexo e oneroso. No que se refere às arritmias cardíacas, estudos anteriores demonstraram que a proteína conhecida como conexina-43 (Cx43), que é o principal componente das junções comunicantes, está alterada. As alterações sofridas pela proteína ocorrem em função do processo de fosforilação em diferentes regiões dessa proteína. Essas modificações prejudicam as formações das junções comunicantes, consequentemente compromete a condução elétrica pelo coração, favorecendo o surgimento das arritmias. Em estudo anterior, foi demonstrado que a expressão de conexina 43, proteína importante para o funcionamento do sistema de condução no coração, está alterada em corações na fase crônica da doença, associada ao aumento da produção de IL-1?. O objetivo do presente projeto investigar se camundongos chagásicos crônicos tratados com inibidores de IL1B e p38MAPK apresentam alterações na localização da Cx43 cardíaca. Para isso, amostras de corações obtidas previamente serão avaliadas quanto a presença de células inflamatórias por coloração com hematoxilina e eosina, e quanto ao percentual de fibrose pela coloração com picrosírius vermelho. Além disso, a distribuição da Cx43 total e fosforilada será avaliada por imunofluorescência nos corações dos camundongos chagásicos crônicos tratados com os inibidores. O estabelecimento desse ensaio permitirá testar potenciais candidatos terapêuticos que possam contribuir para a redução das arritmias cardíacas na doença de Chagas.