Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: Ingrid de Oliveira de Lavigne
Orientador(a): CLAUDIO TADEU DANIEL RIBEIRO
Coorientador(a): LUCIANA PEREIRA DE SOUSA VIEIRA
Resumo: O sistema imune desempenha papel fundamental na função cognitivo-comportamental através de suas propriedades ativadoras ou supressoras da resposta imune e de forma dependente da natureza e da intensidade dos estímulos que exerce. A malária, doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium, é associada a sequelas neurocognitivas, sobretudo quando da sua forma cerebral (a malária cerebral, MC), complicação mais grave e letal em humanos e modelos experimentais. Também se tem relatado a associação de episódios maláricos não-graves ou malária não-complicada (MnC) ao mau desempenho em eventos neurocognitivos, associados ao aprendizado e memória em humanos. Nosso grupo observou um impacto tardio da MnC no desempenho cognitivo em um modelo experimental murino susceptível ao desenvolvimento de MC. No trabalho, a influência de estímulos imunes em diferentes paradigmas cognitivo-comportamentais (memória e ansiedade) foi estudada em camundongos C57BL/6: i) na homeostase e ii) após MnC por Plasmodium berghei ANKA (PbA), modelo experimental clássico de MC, sendo os animais tratados, entretanto, antes do comprometimento cerebral que ocorre no sexto dia de infecção. Observou-se que a infecção pode causar déficits de memória e induzir comportamento ansioso de longo prazo detectados tardiamente após um episódio único de MnC. A imunização com estímulos anti-inflamatórios em sua composição, incluído vacinas largamente usadas em seres humanos como aquela contra a difteria e o tétano (dT), aprimorou a memória de longa duração de camundongos sadios adultos e evitou a manifestação do déficit comportamental detectado tardiamente nos camundongos com episódio prévio de MnC por PbA, sugerindo um efeito promotor benéfico da imunização no desempenho cognitivo-comportamental e reforçando a reconhecida importância do sistema imune na performance neurocognitiva. Recentemente, a comunidade científica dirigiu a sua atenção aos possíveis efeitos do exercício físico, que parece beneficiar a função do sistema imune, no desempenho cognitivo-comportamental. Nossa proposta é estudar a influência de estímulos potencialmente promotores de imunomodulação e alterações fisiológicas e metabólicas, como o exercício físico, em combinação ou não com os estímulos imunes estudados anteriormente mencionados sobre os processos cognitivo-comportamentais na homeostase e após a malária experimental não-complicada.

Bolsista: RAYANI DE OLIVEIRA MARCONDES
Orientador(a): RUBEM FIGUEIREDO SADOK MENNA BARRETO
Coorientador(a): ANA CRISTINA SOUZA BOMBACA
Resumo: O Aedes aegypti é um mosquito pertencente à ordem Diptera: Culicidae, proveniente da África (KAMAL et al., 2018). Essa espécie atua como vetor de diferentes arboviroses com grande importância para a saúde pública, dentre elas dengue, febre amarela, chikungunya e zika, as quais causaram diversos surtos nas populações humanas nas últimas décadas (McGregor, 2020). Strigomonas culicis é um protozoário monoxênico, pertencente à família Trypanosomatidae (Euglenozoa: Kinetoplastea) que apresenta um ciclo de vida exclusivamente na forma epimastigota. Este tripanossomatídeo habita o intestino médio de diferentes mosquitos, dentre os quais está o A. aegypti. Os tripanosomatídeos monoxênicos possuem ciclo de vida exclusivo em hospedeiros invertebrados, principalmente dos insetos da ordem Diptera e Hemiptera (Wallace, 1966), as vias de transmissão destes protozoários entre os insetos ocorre através da ingestão, coprofagia, necrofagia e/ou predação (Maslov et al., 2013), e na maioria dos casos os tripanossomatídeos são considerados não-patogênicos para seus hospedeiros. Tendo em vista que as arboviroses de importância médica vêm sendo estudadas para maior elucidação da sua interação com o hospedeiro, e que as estratégias utilizadas para o controle da propagação e transmissão desses arbovírus são insuficientes, faz-se necessário o estudo de novas estratégias de controle biológico. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram que a infecção por S. culicis (cepas WT e WTR: H2O2-resistente) causam um impacto na postura e produção dos ovos, reduzindo ambos parâmetros pelas fêmeas de A. aegypti. A cepa WTR exacerba a expressão de moléculas do sistema imune do mosquito relacionadas à resposta antiviral (Bombaça et al., 2021). Dessa forma, é possível que a infecção prévia com WTR gere uma resposta antiviral mais intensa. Pretendemos avaliar o impacto da coinfecção entre as cepas selvagem ou H2O2-resistente de S. culicis com os arbovírus CHIKV, DENV e ZIKV in vitro e in vivo.

Bolsista: Letycia Souza Cavalcanti
Orientador(a): ANA CRISTINA GONCALVES VAZ DOS REIS
Coorientador(a): Não informado
Resumo: As informações e registros em saúde enquanto área de saberes e de práticas ganham, cada vez mais, importância para as atividades de gestão em saúde, assim como na atenção e promoção da saúde, sobretudo na Atenção Básica. No entanto, a pulverização das informações em diferentes sistemas, a não interface entre eles e a necessidade de readequar a gestão das informações fez com que o Departamento de Atenção Básica (DAB/MS), desenvolve-se, em 2012, a estratégia e-SUS AB. Espera-se que com a implantação dessa estratégia seja possível integrar os diferentes sistemas de informação na atenção básica, realizar o registro da situação de saúde de forma individualizada por meio do Cartão Nacional de Saúde e melhorar a capacidade de autoavaliação do nível local. Diante desse contexto, este projeto de pesquisa pretende responder a seguinte questão: Em que medida a estratégia e-SUS AB promoveu a integração dos SIS de abrangência nacional na atenção primária à saúde do município de Piraí?

Bolsista: LUANNA DA SILVA VENTURA
Orientador(a): ANDREZA PAIN MARCELINO
Coorientador(a): ISABELA CORDEIRO DA SILVA SANTOS
Resumo: O diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) tem sido um problema para os serviços públicos de saúde, devido à variedade de sinais clínicos, semelhantes a outras doenças, e baixa sensibilidade e especificidade dos testes disponíveis. Um recente avanço no diagnóstico de diversas doenças infecciosas foi o desenvolvimento da técnica “loop-mediated isothermal amplification–LAMP”. Para avaliação deste é método é necessário a construção de um painel bem caracterizado de amostras clínicas. No estado do Rio de Janeiro existe a ocorrência simultânea de leishmaniose tegumentar-LT e leishmaniose visceral-LV em seres humanos e animais. Sendo assim, a identificação etiológica dos animais infectados é muito importante, considerando a diversidade clínica das leishmanioses, a expansão geográfica e sobreposição de áreas para ambas as doenças. O objetivo deste estudo é determinar a classificação clínica dos animais bem como identificar as espécies de Leishmania isoladas nas amostras clínicas dos cães a serem incluídos na avaliação do desempenho da técnica “Loop-mediated isothermal amplification” (LAMP) para diagnóstico da LVC. Serão utilizadas amostras de aspirado de linfonodo poplíteo, medula óssea e células da conjuntiva provenientes de carcaças de aproximadamente 80 animais oriundos do projeto “Ocorrência de Brucella canis e Coxiella burnetii em cães sorologicamente positivos para Leishmania infantum”, CEUA LW 24/17, da equipe de zoonoses do INI, responsáveis pela caracterização clinica dos cães. Os exames parasitológicos diretos serão conforme Barcia, 2007. As amostras serão semeadas em tubos com meio de cultura bifásico NNN + meio Schneider’s, contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos e identificação por técnica de eletroforese de isoenzimas segundo Cupolillo et al., 1994. Os protocolos de PCR utilizados para LAMP serão hsp70 (não publicado), kDNA e k26(7) e para PCR convencional(8) kDNA/145 pb. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA Embora, nas últimas décadas, tenha ocorrido um grande avanço tecnológico, o diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral humana (LVH) e canina (LVC) ainda se apresenta como um desafio, provavelmente por ser uma doença negligenciada, com pouca perspectiva de retorno comercial ao investimento em pesquisa e desenvolvimento. No entanto, trata-se de doença grave, e o diagnóstico precoce e eficaz, tanto humano quanto canino é fundamental para o efetivo controle da doença. Os métodos sorológicos, eleitos para investigação em massa apresentam limitações tais como: possibilidade de reação cruzada com outras doenças; persistência de títulos de anticorpos positivos por longos períodos, mesmo após o tratamento; baixa sensibilidade em animais imunossuprimidos; e, geralmente, a necessidade de infraestrutura laboratorial, com profissionais bem capacitados (9–11). Os resultados presentes na literatura para o desempenho do LAMP para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina são promissores, mas não são representativos para a população nacional, pois até o momento não foi avaliado no Brasil. O desenvolvimento e a avaliação de novos ensaios de LAMP-LVC direcionados para detecção de L. infantum considerando a realidade nacional poderá tornar acessível um diagnóstico eficaz, de simples realização e interpretação, com o potencial de uso por profissionais de laboratórios locais, pertencentes aos serviços periféricos de saúde. Os programas de vigilância e controle das leishmanioses englobam estratégias diferenciadas de acordo com a área em questão e visam interromper o ciclo de transmissão. Na leishmaniose visceral-LV, uma das estratégias e o recolhimento e eutanásia de cães infectados, já que esse animal é o principal reservatório da doença. No entanto, essa recomendação não é empregada em áreas de LT, considerando que o cão não atua como reservatório de L. (V.) braziliensis (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017). A LT é encontrada em praticamente todos os municípios do estado do Rio de Janeiro (RJ) e é causada principalmente por L. (V.) braziliensis, sendo também encontrada a presença autóctone de L. (L.) amazonensis AZEREDO-COUTINHO et al, 2007). No estado do Rio de Janeiro existe a ocorrência simultânea de leishmaniose tegumentar-LT e leishmaniose visceral em seres humanos e animais. Sendo assim, a identificação etiológica dos animais infectados utilizados no estudo é muito importante, considerando a diversidade clínica das leishmanioses, a expansão geográfica e sobreposição de áreas para ambas as doenças.

Bolsista: JULIANA APARECIDA VIEIRA DE AMORIM
Orientador(a): Andreimar Martins Soares
Coorientador(a): Não informado
Resumo: Os venenos de serpentes são uma combinação de diversas proteínas e enzimas, que possuem ações tanto em presas como em vítimas, onde o principal objetivo é afetar os sistemas fisiológicos vitais de suas presas. Muitas dessas proteínas executam múltiplos papéis importantes, como matar ou imobilizar presas, bem como auxiliar no processo de digestão. Contudo, há décadas que pesquisas vêm transformando algumas dessas toxinas em uma fonte terapêutica. No Brasil, devido à grande biodiversidade, apresenta um vasto campo para bioprospecção de venenos de serpentes, com destaque para os gêneros Bothrops e Crotalus. Levando em consideração, o grande potencial para pesquisa de novas biomoléculas provenientes desses venenos, onde a composição pode ainda ser influenciada por fatores de alimentação, idade da serpente e localização geográfica onde se encontra, é necessário explorar os venenos, com técnicas de isolamento e purificação, juntamente às ferramentas alternativas como a bioinformática, de modo a auxiliar no tratamento de doenças infecciosas e parasitoses como a Leishmaniose. Portanto, o objetivo é investigar a Tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis como alvo molecular para prospecção de novos inibidores: Avaliação de componentes ativos da serpente Crotalus durissus com atividade antiparasitária. Metodologias de Bioquímica, Biologia Molecular, Bioinformática, Biotecnologia e Biologia celular serão utilizadas para (i) obter a enzima recombinante tripanotiona redutase (TRLb-Leishmania braziliensis) na forma ativa e elevado grau de pureza; (ii) identificar moléculas de veneno da serpente Crotalus durissus com atividade inibitória sobre a capacidade catalítica da TRLb; (iii) avaliar atividade leishmanicida contra L. amazonensis e L. braziliensis (promastigotas e amastigotas); e (iv) avaliar as interações in vitro e in silico entre o alvo molecular e os inibidores. Por meio do programa Clustal W, temos a sequência do RNA mensageiro identificada de 1475 pb (chromosome: 5; NC_009298.2 LBRM_05_0350), e a correspondente sequência de aminoácidos do alvo a ser expresso (XP_001561849.1; EC 1.8.1.12). A partir da sequência de aminoácidos codificados pela TRLb, será realizado um alinhamento múltiplo com sequências pertencentes a L. panamensis, L. infantum, L. donovani, L. mexicana, L. major, L. brucei e T. cruzi. O processo de síntese e otimização do gene de interesse no vetor de expressão será realizado pela empresa FastBio®. Para obtenção do plasmídeo recombinante, a sequência correspondente a TRLb será inserida no vetor de expressão pET 28(a+) (Novagen®). À sequência será adicionada uma região codificante de polihistidinas (6x) e sítios de restrição para as enzimas NcoI e XhoI. Estas enzimas serão previamente selecionadas após verificação dos sítios de corte na sequência será utilizado o programa Web Cutter®. A propagação do plasmídeo recombinante e transformação bacteriana, por meio de duas cepas de E. coli, sendo uma delas para replicar o plasmídeo (TG1), e a outra para realizar a expressão da enzima [BL21 (DE3)], utilizando choque térmico. A Recuperação do plasmídeo recombinante da TR e quantificação, por meio das células da cepa TG1 de E. coli transformadas com o vetor recombinante pET 28(a+)TRLb para amplificação. Análise da expressão da tripanotiona redutase recombinante utilizando técnica eletroforética e a purificação da enzima recombinante expressa, empregando a cromatografia por afinidade em resina de níquel Ni-NTA (ácido níquelnitrilotriacético) Agarose (QIAGEN®), seguindo as instruções do fabricante. Após isolada a tripanotiona, serão realizados os testes para a avaliação da atividade inibitória, seguindo a ordem: (i) avaliação da atividade enzimática da tripanotiona redutase recombinante utilizando espectrofotômetro Eon Biotek® e o software Gen5®, de acordo com o protocolo de atividade previamente descrito e em colaboração com o Laboratório de Protozoología da Universidade Federal de Santa Catarina e (ii) avaliação da atividade inibitória para frações e/ou toxinas isoladas específicas de venenos de serpente. Para os testes in vitro, serão realizados os ensaios de atividade antipromastigota contra Leishmania amazonenses e Leishmania braziliensis. As formas promastigotas de L. amazonensis (cepa IFLA/BR/67/PH8) e L. braziliensis (cepa MHOM/BR/2014/310), obtidas da Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz serão mantidas congeladas até o momento do uso no banco da mencionada plataforma.

Bolsista: JADE LIZ FERREIRA MENDES SOUZA
Orientador(a): Patricia Sampaio Tavares Veras
Coorientador(a): Maria Borges Rabêlo de Santana
Resumo: As leishmanioses são doenças negligenciadas cujos tratamentos incluem a aplicação de antimoniais pentavalentes, anfotericina B, entre outros. Esses tratamentos apresentam limitações como alto custo, tempo prolongado e efeitos colaterais que, em conjunto, evidenciam a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos. A proteína de choque térmico 90 (Hsp90), uma chaperona molecular, surge como um alvo quimioterápico para o tratamento da leishmaniose. Estudos do nosso grupo mostraram que inibidores da Hsp90 foram eficazes contra Leishmania spp., em doses não tóxicas para o hospedeiro, in vivo e in vitro. Em estudo ainda não publicado, demonstramos que o tratamento diário, por via intraperitoneal, de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis com 20 mg/kg de 17-DMAG, um inibidor da Hsp90, reduziu a carga parasitária, o diâmetro da lesão e a produção de citocinas proinflamatórias, em comparação ao grupo não tratado. No entanto, os animais tratados apresentaram sinais de toxicidade após seis semanas. Assim, objetivamos produzir e caracterizar nanopartículas poliméricas (NP) de PLGA contendo o 17-DMAG, que permitirão a liberação controlada do fármaco, a redução da dose utilizada e, consequentemente, a diminuição dos efeitos colaterais. A princípio, NP foram produzidas por dois métodos de emulsão dupla (P1 e P2) e caracterizadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), quanto ao tamanho, formato e aspecto de superfície. O tamanho médio, índice de polidispersão (PdI) e a carga de superfície (potencial zeta - ZP) foram mensurados por Dynamic Light Scattering (DLS), e a eficiência de encapsulamento (%EE) foi medida por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). P1 e P2 produziram NP esféricas e de superfície lisa e as NP produzidas por P2 (NP2) apresentaram melhores características que NP1, como menor tamanho (305.5 nm vs 489 nm), menor PdI (0.129 vs 0.33), maior potencial zeta (-28,7 vs -34,4 mV) e maior %EE (15,04% vs 14,9% - análise por sobrenadante - e 17% vs 14.02% - análise por filtro/coluna). Depois, foi avaliada a influência da massa de PLGA (100 ou 200 mg) ou da concentração de PEG (2,5% ou 5%) no tamanho médio e %EE do 17-DMAG nas NP. 100 mg de PLGA produziu NP menores, comparadas àquelas preparadas com 200 mg [336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6) vs 387.8 nm (Q1: 382.8; Q2: 396.7)] e o uso de 5% de PEG gerou NPs menores que o emprego de 2,5% [297.2 nm (Q1: 288.6; Q2:304.1) vs 336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6)]. Também, foram avaliados os perfis de liberação do 17-DMAG das NP otimizadas (NP2-17-DMAG) e a captação de NP por macrófagos derivados de medula óssea (BMMØ). Os resultados mostraram que o 17-DMAG foi liberado continuamente das NP2-17-DMAG ao longo de 72 h. Além disso, foi observado que BMMØ são capazes de captar e manter NPs no citoplasma após 30 min, 1, 2, 4, 6, 24, 48 ou 72 h. Ademais, a citotoxicidade (CC50) de NP2-17-DMAG sobre BMMØ e a eficácia sobre amastigotas intracelulares de L. braziliensis (IC50) foram avaliadas, in vitro. O CC50 de NP2-17-DMAG foi 10,9 vezes menor que o valor de CC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [0,294 µM (0,29 ± 0,08) vs 3,2 µM (3,2 ± 1,06), respectivamente]. O IC50 de NP2-17-DMAG foi 3,36 vezes maior que o valor de IC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [26,01 nM (26,01 ± 13,59) vs 7,72 nM (Q1: 4,14; Q3: 10,35), respectivamente]. Juntos, os dados mostraram que o encapsulamento do 17-DMAG pelo protocolo NP2 otimizado nesses ensaios, em comparação com o composto livre, aumentou a toxicidade do 17-DMAG sobre BMM? e reduziu sua eficácia no controle da infecção de BMM? por L. braziliensis, in vitro. Para otimizar o efeito leishmanicida com baixa toxicidade, ensaios futuros envolverão a análise, por meio de DSC e FTIR, de possíveis alterações químicas nas NP2-17-DMAG, oriundas de interações entre a NP e o fármaco e buscar por meio de alteração de pH e adição de sais, promover um aumento da %EE do 17-DMAG em NPs.